SDC2 Antibody (Mouse mAb) [D5J9]

目录号：F5109

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生物描述

特异性 SDC2 Antibody (Mouse mAb) [D5J9] 可检测内源性 SDC2 总蛋白水平。
背景 SDC2（syndecan-2）是syndecan家族中的一种I型跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其胞外核心蛋白表面修饰有硫酸乙酰肝素链，并作为一种多功能细胞表面共受体，整合细胞外基质、生长因子和形态发生素信号与细胞骨架组织和细胞内激酶通路。该蛋白包含一个短的N端信号肽、一个带有硫酸乙酰肝素连接位点的腔内胞外结构域、一个跨膜区段以及一个胞质尾，胞质尾具有保守的C1和C2基序以及一个可结合PDZ结构域支架和信号转导衔接蛋白的可变区；这种模块化结构使SDC2能够在膜微区聚集，并在细胞-基质和细胞-细胞接触位点组装信号复合物。 SDC2上的硫酸乙酰肝素链可结合多种配体，包括纤连蛋白、血小板反应蛋白、FGF2、EGF家族配体以及其他细胞外基质和生长因子。这些相互作用促进配体呈递给受体酪氨酸激酶和整合素，调节配体梯度，并促进整合素活化、PI3K-Akt和Ras-Raf-MEK-ERK信号通路以及肌动蛋白细胞骨架的重组，这些共同支持细胞增殖、黏附和定向迁移。在神经组织中，SDC2富集于突触后，并调节树突棘和树突状结构的形态发生。突触后SDC2募集并组织FGF22依赖的跨突触信号传导，协调突触前和突触后组装，这表明SDC2作为突触组织者，将硫酸乙酰肝素介导的配体结合与局部细胞骨架和受体重排偶联起来。在发育和上皮形态发生过程中，SDC2参与特化上皮中FGF2和FGF受体依赖的信号传导，并在多个系统中通过调节生长因子的局部可用性和受体结合以及调控下游ERK和PI3K通路，影响分支形态发生、血管生成和组织模式形成。在结直肠癌中，SDC2表达显著上调，该蛋白促进细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）。敲低SDC2可降低p-MEK/MEK和p-ERK/ERK的比值，并逆转EMT标志物的变化，这表明SDC2通过增强MAPK信号通路和EMT程序来促进肿瘤进展。进一步的研究表明，SDC2通过作用于miR-20b-5p的下游并激活JNK/ERK信号通路，参与结直肠癌的5-氟尿嘧啶耐药；SDC2过表达可提高5-FU处理细胞的存活率，而抑制SDC2则可恢复药物敏感性，这揭示了miR-20b-5p/SDC2-JNK/ERK轴将SDC2表达与化疗耐药联系起来。 SDC2在癌细胞来源的细胞外囊泡中也大量存在，并与纤连蛋白和其他物质共同包装，在囊泡生物合成和细胞间通讯中发挥作用，从而在肿瘤微环境中传播促转移信号。SDC2在神经系统和其他组织中的表达使其与树突和突触发育、伤口愈合、血管生成和免疫信号传导密切相关。SDC2基因甲基化正被开发为一种用于早期检测结直肠肿瘤的非侵入性表观遗传生物标志物，粪便或血浆中SDC2 DNA的高甲基化反映了这种信号蛋白聚糖的肿瘤相关表观遗传改变。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:2000-1:10000 1:250-1:1000
反应性 Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 22 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: HuH7, Lane 2: HepG2, Lane 3: A549, Lane 4: Jurkat