SDF-1 Antibody (Rabbit mAb) [M4G11]

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生物描述

特异性 SDF-1 Antibody (Rabbit mAb) [M4G11] 可检测内源性 SDF-1 总蛋白水平。
背景 SDF-1，又称CXCL12，是一种CXC趋化因子，是表达CXCR4的造血和内皮祖细胞、神经细胞以及多种白细胞亚群的关键滞留和归巢信号，使其成为组织定植、免疫细胞迁移以及包括骨髓、缺血组织和神经系统在内的多个器官修复反应的核心组织者。该趋化因子具有典型的趋化因子折叠结构，包含一个用于受体激活的N端区域、一个三链β折叠和一个参与受体和糖胺聚糖结合的C端α螺旋，在基质和内皮表面形成梯度，引导CXCR4阳性细胞沿着SDF-1浓度场迁移。 SDF-1与G蛋白偶联受体CXCR4的结合触发Gi依赖性信号通路，并迅速磷酸化RAFTK/Pyk2、FAK、paxillin、p130Cas和Crk家族衔接蛋白等黏着斑相关蛋白，从而重组黏着斑和肌动蛋白细胞骨架，驱动CD34阳性造血祖细胞向SDF-1来源定向迁移。CXCR4的结合还能募集并激活PI3K和蛋白激酶C，抑制这些酶可阻断SDF-1诱导的黏着斑蛋白磷酸化和迁移反应，表明PI3K和PKC是连接趋化因子受体激活与黏附动力学和细胞运动的关键中间体，而ERK1/2活性对于该特定迁移程序并非必需。在骨髓微环境中，基质细胞和内皮细胞持续产生SDF-1，从而维持CXCR4阳性的造血细胞和促血管生成细胞的存活；而SDF-1梯度或CXCR4活性的调节则可将这些细胞动员到血液循环中，从而将该通路与体内平衡、缺血修复和肿瘤血管生成过程中干细胞和祖细胞的迁移直接联系起来。在缺血和肿瘤微环境中，SDF-1水平升高可将CXCR4阳性、VEGFR1阳性的造血细胞和内皮祖细胞募集到新生血管形成部位；而血管细胞和基质成分上的CXCR4的结合则可增强血管重建、稳定血管，并支持组织重塑或肿瘤生长。在神经系统中，SDF-1通过CXCR4作用于神经祖细胞、小脑颗粒细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和伤害性神经元，调节细胞迁移、增殖、细胞因子和谷氨酸释放、突触反应以及伤害性信号传导，从而参与大脑发育、神经炎症调节和疼痛通路。该趋化因子-受体对参与多种病理生理过程，包括脑肿瘤、实验性变应性脑炎和HIV相关神经系统功能障碍，其中SDF-1/CXCR4信号传导的改变会影响白细胞浸润、胶质细胞活化以及神经元存活或兴奋性。在缺血性心血管疾病和癌症中，SDF-1/CXCR4 通过协调促血管生成骨髓细胞的募集和保留，以及直接影响内皮细胞和基质细胞，发挥着新生血管生成的分子枢纽的作用；而对该轴进行药理学调节，如 CXCR4 拮抗，则改变了祖细胞动员和持续募集到血管生成微环境之间的平衡。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IF 稀释比例
WB IF FCM
1:10000-1:50000 1:100-1:250 1:20
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 11 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Human CXCL12 recombinant protein