SDHB Antibody (Rabbit mAb) [P15D13]

目录号：F8108

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生物描述

特异性 SDHB Antibody (Rabbit mAb) [P15D13] 可检测内源性 SDHB 总蛋白水平。
背景 SDHB，即琥珀酸脱氢酶的铁硫亚基B，是一种保守的线粒体内膜蛋白，构成复合物II的核心电子传递模块。它通过三个铁硫簇链将三羧酸循环中琥珀酸氧化为富马酸的过程与呼吸链中泛醌的还原过程连接起来。这三个铁硫簇将电子从SDHA中的FAD传递至膜锚定亚基SDHC/SDHD和辅酶Q。该多肽折叠成一个α/β型结构域，通过保守的半胱氨酸残基协调[2Fe-2S]、[4Fe-4S]和[3Fe-4S]簇。同源建模结合结构分析表明，许多致病性SDHB突变要么破坏折叠结构并阻止功能表达，要么通过改变簇结合残基或周围环境来破坏有序的电子传递路径，导致琥珀酸氧化和醌还原受损，并继发复合物II的组装和活性改变。在复合物 II 中，SDHA 含有 FAD 辅基并催化琥珀酸氧化，而 SDHB 接受由此产生的电子，并通过其 Fe-S 接力将其传递给含血红素的 SDHC/SDHD 二聚体，进而传递给泛醌；这种定位使 SDHB 成为基质脱氢酶化学和膜电子传递之间的关键通道，其完整性对于维持有效的氧化磷酸化和控制琥珀酸水平至关重要。生殖系SDHB突变是遗传性嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征和其他SDH缺陷型癌症的主要病因。基因型-功能相关性研究表明，无义突变、移码突变和某些错义突变会破坏线粒体定位或Fe-S簇的配位，而Cys101Tyr、Pro197Arg和Arg242His等突变则会特异性地破坏电子传递途径，同时保留部分结构，这为SDHB相关家族中不同的外显率和肿瘤谱提供了机制解释。功能性SDHB的丧失会导致琥珀酸的积累，琥珀酸作为一种癌代谢物，通过抑制脯氨酰羟化酶、稳定缺氧诱导因子并驱动假性缺氧转录程序，以及损害α-酮戊二酸依赖性双加氧酶、改变组蛋白和DNA去甲基化而发挥作用。综述研究表明，SDHB缺陷型癌症表现出特征性的代谢重编程、表观遗传改变以及广泛的肿瘤谱，包括嗜铬细胞瘤/副神经节瘤、胃肠道间质瘤、肾细胞癌和垂体腺瘤，这表明SDHB在细胞线粒体代谢和肿瘤发生中起着关键作用。利用计算机模拟、免疫荧光、酶活性测定和呼吸测量等方法对SDHB变异体进行功能表征，证实许多被归类为意义未明变异（VUS）的错义变异会降低SDH活性、改变超复合物的形成或增加线粒体活性氧（ROS）水平，而其他一些变异则表现为良性多态性。这些发现为阐明遗传风险和改进hPPGL的遗传咨询提供了实用框架。 SDHB 缺陷型肿瘤表现为 SDHB 蛋白染色完全丧失，而 SDHA 保留，可作为 SDH 复合物破坏的替代标志物，并指导靶向基因检测；而心脏、肾脏和肌肉等正常组织中线粒体颗粒状染色呈阳性，反映了 SDHB 的高表达，与其氧化需求一致。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, FCM 稀释比例
WB IP IHC FCM
1:50000 - 1:200000 1:10 - 1:100 1:2000 1:10 - 1:200
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 32 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:50000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: 293T, Lane 2: HepG2, Lane 3: A431, Lane 4: Jurkat