Sharpin Antibody [G5P13] Datasheet

生物描述

特异性	Sharpin Antibody [G5P13] 可检测内源性 Sharpin 总蛋白水平。
背景	Sharpin 与 HOIP 和 HOIL-1L 同属 LUBAC 泛素连接酶家族，是形成线性泛素链的关键衔接蛋白。该蛋白具有一个 N 端 pleckstrin 同源 (PH) 结构域，可形成驱动二聚化的四聚体超折叠；一个用于复合物组装的中央泛素样 (UBL) 结构域；以及一个结合线性多泛素链的 C 端 NPL4 锌指 (NZF) 结构域。这些结构域将 Sharpin 定位在 LUBAC 内部，在 TNF-α 或 IL-1 刺激后，将 Met1 连接的泛素连接到 NEMO 和 RIPK1 等底物上。Sharpin 通过 LTM 基序稳定 LUBAC，该基序与 HOIL-1L 共折叠形成一个锚定结构域，从而增强 HOIP 的 RBR 连接酶活性，进而激活 NF-κB 通路。这种线性泛素化可增强经典的NF-κB信号通路，促进免疫细胞中细胞因子、抗凋亡基因和存活因子的转录。Sharpin蛋白募集LUBAC至TNFR1复合物I，通过拮抗caspase-8的切割来阻止RIPK1介导的坏死性凋亡。Sharpin蛋白缺陷会通过损害RelA的激活来破坏B细胞发育和边缘区形成。NZF结构域可感知泛素链，从而在炎症期间增强信号反馈环路。小鼠中功能缺失突变会引发慢性增生性皮炎，伴有嗜酸性粒细胞浸润、溃疡和生长发育迟缓，这是由于TNFR1诱导的细胞凋亡和炎症过度所致。Sharpin蛋白过表达可通过MDM2介导的多聚泛素化促进细胞增殖、侵袭和p53降解，从而驱动乳腺癌和肾细胞癌的进展。它还能通过靶向PTEN增强PI3K/AKT信号通路，并通过激活PRMT5/SOX10轴促进黑色素瘤生长。Sharpin基因突变与自身炎症综合征相关，凸显了其在平衡免疫稳态和防止过度组织损伤方面的重要作用。

特异性

Sharpin Antibody [G5P13] 可检测内源性 Sharpin 总蛋白水平。

背景

Sharpin 与 HOIP 和 HOIL-1L 同属 LUBAC 泛素连接酶家族，是形成线性泛素链的关键衔接蛋白。该蛋白具有一个 N 端 pleckstrin 同源 (PH) 结构域，可形成驱动二聚化的四聚体超折叠；一个用于复合物组装的中央泛素样 (UBL) 结构域；以及一个结合线性多泛素链的 C 端 NPL4 锌指 (NZF) 结构域。这些结构域将 Sharpin 定位在 LUBAC 内部，在 TNF-α 或 IL-1 刺激后，将 Met1 连接的泛素连接到 NEMO 和 RIPK1 等底物上。Sharpin 通过 LTM 基序稳定 LUBAC，该基序与 HOIL-1L 共折叠形成一个锚定结构域，从而增强 HOIP 的 RBR 连接酶活性，进而激活 NF-κB 通路。这种线性泛素化可增强经典的NF-κB信号通路，促进免疫细胞中细胞因子、抗凋亡基因和存活因子的转录。Sharpin蛋白募集LUBAC至TNFR1复合物I，通过拮抗caspase-8的切割来阻止RIPK1介导的坏死性凋亡。Sharpin蛋白缺陷会通过损害RelA的激活来破坏B细胞发育和边缘区形成。NZF结构域可感知泛素链，从而在炎症期间增强信号反馈环路。小鼠中功能缺失突变会引发慢性增生性皮炎，伴有嗜酸性粒细胞浸润、溃疡和生长发育迟缓，这是由于TNFR1诱导的细胞凋亡和炎症过度所致。Sharpin蛋白过表达可通过MDM2介导的多聚泛素化促进细胞增殖、侵袭和p53降解，从而驱动乳腺癌和肾细胞癌的进展。它还能通过靶向PTEN增强PI3K/AKT信号通路，并通过激活PRMT5/SOX10轴促进黑色素瘤生长。Sharpin基因突变与自身炎症综合征相关，凸显了其在平衡免疫稳态和防止过度组织损伤方面的重要作用。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

43 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: DU145, Lane 2: PC-3, Lane 3: MCF7, Lane 4: T-47D