SMCR7L/MID51 Antibody (Mouse mAb) [L21F3]

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生物描述

特异性 SMCR7L/MID51 Antibody (Mouse mAb) [L21F3] 可检测内源性 SMCR7L/MID51 总蛋白水平。
背景 SMCR7L，又称MiD51或MIEF1，是一种动力蛋白受体家族的线粒体外膜蛋白，它通过控制分裂介质动力蛋白相关蛋白1 (Drp1) 的募集和活性来调节线粒体形态，从而调节线粒体分裂和融合之间的平衡，并影响细胞器分布、生物能量学和应激反应。该蛋白包含一个N端单次跨膜区段，将其锚定于线粒体外膜；以及一个C端胞质结构域，该结构域具有一种变异的核苷酸转移酶折叠，缺乏催化活性，但保留了一个结构化的口袋，该口袋能以高亲和力结合ADP，以较低亲和力结合GDP；这种折叠并非作为酶发挥作用，而是作为蛋白质-蛋白质相互作用平台，为Drp1的结合提供表面，并作为调控界面将核苷酸结合与构象变化联系起来。 MiD51 作为 Drp1 的受体，促进其募集并结合到线粒体表面，而无需其他裂变衔接蛋白，如 FIS1 和 MFF。结构和生物物理分析表明，ADP 与 MiD51 的结合是刺激 Drp1 GTPase 活性并组装成线粒体周围长螺旋管所必需的；而当没有结合 ADP 时，MiD51 会抑制 Drp1 GTPase 活性并促进效率较低的寡聚状态，这表明 MiD51 将核苷酸状态整合到 Drp1 介导的收缩和分裂的控制中。 Drp1与MiD51的相互作用还受到Drp1的GTP结合和聚合状态的调控。突变定位分析发现MiD51上有两个区域可直接结合Drp1，并且MiD51的二聚化（依赖于C452残基）对于有效调控线粒体动力学至关重要。这建立了一种多界面机制，其中MiD51寡聚化和Drp1丝状体的形成协同作用，共同决定线粒体分裂的位点和效率。对脊椎动物细胞中MiD51的功能研究表明，MiD51表达升高会导致线粒体分布发生显著变化，并可导致线粒体管状结构延长和融合；而MiD51表达降低则会导致线粒体断裂。这些结果支持了MiD51在组织分裂复合物和抑制过度分裂方面发挥着依赖于细胞环境的作用，并且它有助于维持健康的线粒体网络，而健康的线粒体网络对于能量稳态、钙离子处理以及在代谢和氧化应激下的细胞存活至关重要。在胰岛和β细胞系中，MiD51对于维持葡萄糖刺激胰岛素分泌过程中线粒体的健康至关重要。MiD51表达或功能的改变会扰乱线粒体动力学，损害ATP生成并破坏胰岛素释放，从而将MiD51调控的线粒体分裂机制与内分泌细胞功能以及2型糖尿病相关的β细胞功能障碍联系起来。MiD51还与心肌细胞生理、神经元发育和病毒免疫逃逸有关，包括与丙型肝炎病毒的相互作用，这种相互作用会影响线粒体形态和抗病毒信号传导。这表明，MiD51活性失调会导致线粒体碎片化、生物能量学受损以及在疾病状态下细胞凋亡易感性增加。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IF 稀释比例
WB IHC IF
1:5000-1:50000 1:250-1:1000 1:200-1:800
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 51 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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