Snail + Slug N-terminal Antibody (Mouse mAb) [E10J13]

目录号：F3674

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生物描述

特异性 Snail + Slug N-terminal Antibody (Mouse mAb) [E10J13] 可检测内源性总 Snail 和 Slug 蛋白水平，通常识别其 N 端区域。
背景 SNAIL 和 SLUG（也称为 SNAI1 和 SNAI2）属于 SNAIL 锌指转录因子家族，该家族驱动上皮-间质转化。这两个蛋白都具有一个保守的 N 端 SNAG 结构域，该结构域作为主要的抑制模块发挥作用，与 C 端锌指 DNA 结合区不同。SNAG 结构域的结构类似于组蛋白 H3 的 N 端尾部，使其能够作为假底物钩直接与组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶 LSD1 的氨基氧化酶结构域对接。这种相互作用稳定了靶基因启动子（尤其是 E-钙黏蛋白启动子 CDH1）上的三元 Snail1-LSD1-CoREST 复合物。一旦该复合物组装完成，转录沉默就会通过一个确定的多阶段序列进行：CoREST-Snail1-LSD1 复合物中的 HDAC1 和 HDAC2 首先使组蛋白 H3 和 H4 去乙酰化，然后以一种需要启动子上完整的 Snail1 结合位点和 SNAG 结构域本身的方式募集 Polycomb 抑制复合物 2，指导组蛋白 H3 赖氨酸 27 的三甲基化，随后 LSD1 去除激活的 H3K4 甲基化标记，共同将活性启动子转化为稳定沉默的启动子。在Slug蛋白中，位于N端的SNAG结构域直接募集辅阻遏物NCoR，而另一个称为SLUG结构域的中央区域则募集CtBP1。利用结构域缺失构建体进行的功能分析表明，SNAG结构域是EMT诱导的绝对必需结构域，而SLUG结构域有助于有效抑制E-钙黏蛋白的表达，但缺失后会对SNAG驱动的EMT诱导以及NCoR辅阻遏物的活性产生负调控作用。SNAIL和SLUG都需要其SNAG结构域来抑制E-钙黏蛋白的启动子，但这两个旁系同源蛋白中控制辅阻遏物募集的结构域组成不同。Slug依赖于两个不同的、功能可分离的结构域来募集不同的辅阻遏物复合物，而不是依赖于单一的共享抑制界面。 SNAG-LSD1 相互作用可直接作为药物靶点：使用酶抑制剂 Parnate 对 LSD1 进行药理学抑制，或使用与 Slug SNAG 结构域相对应的细胞渗透性 TAT-SNAG 肽进行竞争性阻断，可破坏 Slug 依赖的 E-钙黏蛋白启动子抑制，并抑制不同来源的肿瘤细胞系的运动和侵袭，而不影响细胞增殖，这表明 SNAG 结构域与染色质修饰酶的相互作用在机制上与其他 SNAIL 和 SLUG 功能是可分离的，并且代表了 EMT 驱动的癌症侵袭中一个明确的治疗干预点。

使用信息

抗体应用 IHC, IF 稀释比例
IHC IF
1:5000 - 1:10000 1:200-1:1000
反应性 Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 29 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IHC

Validated by Selleck

  • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human colon tissue with F3674 at 1:5000 dilution.