SNX27 Antibody (Rabbit mAb) [P13M24] Datasheet

生物描述

特异性	SNX27 Antibody (Rabbit mAb) [P13M24] 可检测内源性 SNX27 总蛋白水平。
背景	SNX27 属于 PX 结构域转运蛋白的分类衔接蛋白家族，其功能是作为外周膜货物衔接蛋白，由三个结构域组成，从 N 端到 C 端依次排列：PDZ 结构域用于选择跨膜货物，中央 PX 结构域用于结合内体脂质磷脂酰肌醇 3-磷酸，C 端 FERM 样结构域用于结合另一类含有 NPxY/NxxY 的货物基序，这使得 SNX27 单个分子上具有两个结构不同的货物识别表面。内吞作用后，携带 C 端 PDZ 结合基序的内化跨膜蛋白被递送至早期内体，SNX27 的 PDZ 结构域捕获该基序，并将货物从默认的溶酶体降解途径转移回质膜。对与逆转录酶亚基 VPS26A 结合的 SNX27 PDZ 结构域的晶体结构和 NMR 分析表明，SNX27 PDZ 结构域内暴露的 β-发夹插入（这是典型的 PDZ 结构域所不具备的特征）与 VPS26A 阻遏蛋白样折叠的两个叶之间形成的保守凹槽相接合，并且该 PDZ 结构域表面同时容纳了逆转录酶结合的 β-发夹相互作用和 PDZ 结合基序货物相互作用，从而在结构上将货物捕获与逆转录酶结合耦合起来，而不是将它们视为连续的、独立的结合事件。这种耦合在功能上是协同的：VPS26A 与 SNX27 PDZ 结构域的结合使该结构域对货物 PDZ 结合基序的亲和力提高了大约一个数量级，这意味着逆转录酶的参与主动增强了货物选择性，而不是被动地跟随它，破坏 SNX27-VPS26A 结合界面会消除货物从内体到质膜的循环。除了由VPS26、VPS29和VPS35组成的核心逆转录酶三聚体之外，SNX27-逆转录酶还通过FAM21亚基与WASH复合物偶联。FAM21亚基通过不同的、不重叠的基于基序的接触位点与逆转录酶和SNX27结合。这种与WASH的结合驱动肌动蛋白聚合，将内体膜组织成管状亚结构域，SNX27结合的货物由此被包装到循环载体中。因此，内体膜上货物浓度的增加会募集逆转录酶-SNX27，后者反过来又募集WASH来构建循环步骤所需的管状结构。SNX27还通过磷酸化依赖性结合位点与磷酸化货物结合，这些位点替代了通常高亲和力PDZ结合所需的酸性残基，从而将SNX27的货物范围扩展到缺乏典型酸性序列基序的受体，例如β2肾上腺素能受体和NMDA受体。

特异性

SNX27 Antibody (Rabbit mAb) [P13M24] 可检测内源性 SNX27 总蛋白水平。

背景

SNX27 属于 PX 结构域转运蛋白的分类衔接蛋白家族，其功能是作为外周膜货物衔接蛋白，由三个结构域组成，从 N 端到 C 端依次排列：PDZ 结构域用于选择跨膜货物，中央 PX 结构域用于结合内体脂质磷脂酰肌醇 3-磷酸，C 端 FERM 样结构域用于结合另一类含有 NPxY/NxxY 的货物基序，这使得 SNX27 单个分子上具有两个结构不同的货物识别表面。内吞作用后，携带 C 端 PDZ 结合基序的内化跨膜蛋白被递送至早期内体，SNX27 的 PDZ 结构域捕获该基序，并将货物从默认的溶酶体降解途径转移回质膜。对与逆转录酶亚基 VPS26A 结合的 SNX27 PDZ 结构域的晶体结构和 NMR 分析表明，SNX27 PDZ 结构域内暴露的 β-发夹插入（这是典型的 PDZ 结构域所不具备的特征）与 VPS26A 阻遏蛋白样折叠的两个叶之间形成的保守凹槽相接合，并且该 PDZ 结构域表面同时容纳了逆转录酶结合的 β-发夹相互作用和 PDZ 结合基序货物相互作用，从而在结构上将货物捕获与逆转录酶结合耦合起来，而不是将它们视为连续的、独立的结合事件。这种耦合在功能上是协同的：VPS26A 与 SNX27 PDZ 结构域的结合使该结构域对货物 PDZ 结合基序的亲和力提高了大约一个数量级，这意味着逆转录酶的参与主动增强了货物选择性，而不是被动地跟随它，破坏 SNX27-VPS26A 结合界面会消除货物从内体到质膜的循环。除了由VPS26、VPS29和VPS35组成的核心逆转录酶三聚体之外，SNX27-逆转录酶还通过FAM21亚基与WASH复合物偶联。FAM21亚基通过不同的、不重叠的基于基序的接触位点与逆转录酶和SNX27结合。这种与WASH的结合驱动肌动蛋白聚合，将内体膜组织成管状亚结构域，SNX27结合的货物由此被包装到循环载体中。因此，内体膜上货物浓度的增加会募集逆转录酶-SNX27，后者反过来又募集WASH来构建循环步骤所需的管状结构。SNX27还通过磷酸化依赖性结合位点与磷酸化货物结合，这些位点替代了通常高亲和力PDZ结合所需的酸性残基，从而将SNX27的货物范围扩展到缺乏典型酸性序列基序的受体，例如β2肾上腺素能受体和NMDA受体。

使用信息

抗体应用

WB, IP, FCM

稀释比例

WB	IP	FCM
1:500-1:1000	1:30	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

61 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: K-562, Lane 2: Jurkat, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain