SOAT1/ACAT1 Antibody (Rabbit mAb) [E19E10]

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生物描述

特异性 SOAT1/ACAT1 Antibody (Rabbit mAb) [E19E10] 可检测内源性 SOAT1/ACAT1 总蛋白水平。
背景 甾醇 O-酰基转移酶 1 (SOAT1)，又称酰基辅酶 A：胆固醇酰基转移酶 1 (ACAT1)，是一种内质网驻留膜酶，它利用长链脂肪酰基辅酶 A 催化游离胆固醇和氧固醇转化为胆固醇酯，从而支持包括巨噬细胞、血管平滑肌细胞和许多其他组织在内的多种细胞类型的细胞内胆固醇稳态和脂滴生物合成，并在这些组织中广泛表达。 ACAT1/SOAT1 含有甾醇结合区，可容纳带有 3β-羟基的底物，并将其与脂双层内的脂肪酰辅酶 A 偶联。它作为一种变构酶，受胆固醇和氧固醇激活，并将脂蛋白衍生的甾醇和局部生成的氧固醇整合到酯化途径中，从而控制晚期内体、溶酶体和内质网中的游离胆固醇水平。在暴露于修饰低密度脂蛋白的巨噬细胞中，SOAT1 驱动富含胆固醇酯的中性脂滴的形成，并促进泡沫细胞的形成。同时，SOAT1 的酯化作用与中性胆固醇酯水解酶的水解作用之间的动态循环调节着储存胆固醇和游离胆固醇之间的平衡，进而影响膜组成、细胞器功能以及胆固醇晶体形成的敏感性。在动脉粥样硬化病变中，髓系细胞中的 SOAT1 活性支持胆固醇酯的积累和富含泡沫细胞的斑块的形成，但选择性地删除髓系中的 Acat1 会改变炎症信号：缺乏 ACAT1 或用特异性 ACAT1 抑制剂 (K604) 处理的巨噬细胞在用乙酰化 LDL 加载胆固醇后，iNOS、COX2 和多种趋化因子等促炎介质的诱导减少，这表明胆固醇酯化能力与先天免疫激活的转录程序之间存在直接联系。这种炎症输出的调节与斑块生物学的变化相一致，因为在 ApoE 缺陷小鼠中，髓系特异性 Acat1 敲除会降低晚期主动脉病变中的巨噬细胞含量，减少斑块总面积，并降低坏死核心中的胆固醇晶体负荷，而不会增加细胞凋亡，从而将 SOAT1 介导的胆固醇酯形成与泡沫细胞密度和溶酶体损伤胆固醇晶体的生成联系起来，这些胆固醇晶体会激活炎症小体通路。除了巨噬细胞外，病变中的血管平滑肌细胞和其他非髓系细胞也表达SOAT1和ACAT2。暴露于氧固醇25-羟基胆固醇会增加平滑肌细胞中SOAT1蛋白的水平，并增强胆固醇酯的合成，而胆固醇酯的合成主要依赖于ACAT1。这表明，在晚期斑块中富含氧固醇的环境会增强巨噬细胞和平滑肌细胞的酯化能力，即使在髓系SOAT1缺失的情况下也能维持泡沫细胞的形成。这些数据表明，SOAT1处于膜固醇负荷、氧固醇信号传导和免疫效应功能的交汇点：酯化作用会抑制游离胆固醇的积累和氧固醇的毒性，但同时也会促进泡沫细胞的持续存在，并通过维持富含脂滴的细胞（这些细胞分泌细胞因子和基质降解酶）来促进斑块的进展。在系统生理学中，SOAT1 的普遍表达表明其在类固醇生成组织、肝脏、脂肪组织和神经系统中发挥作用，其机制是通过调节可及胆固醇池，为类固醇生成、脂蛋白分泌和特化膜结构域提供物质。同时，其内质网定位和对甾醇组成的响应性提示其可能整合到更广泛的胆固醇感知网络中，例如 SREBP 和氧固醇驱动的转录程序。尽管这些关联是基于其酶学特性以及在病变和细胞培养模型中描述的甾醇环境推断而来。在病理学上，SOAT1 通过促进巨噬细胞和平滑肌细胞中泡沫细胞的形成而促进动脉粥样硬化。在小鼠和人类的晚期病变中，富含巨噬细胞和富含平滑肌的区域均含有 SOAT1 和 ACAT2，这表明选择性或联合调节这些酶可以重塑斑块的脂质结构和炎症状态。在髓系细胞中实验性抑制或基因删除 ACAT1/SOAT1 可保护高脂血症小鼠免受晚期动脉粥样硬化的负担，主要通过减少巨噬细胞浸润和胆固醇晶体含量，以及在胆固醇负荷条件下将巨噬细胞转向炎症性较低的表型，这已确立 SOAT1 为将胆固醇酯化与血管疾病中的先天免疫信号联系起来的机制节点。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF 稀释比例
WB IP IHC IF
1:1000 1:1000 1:1000 1:250
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 65 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Hela, Lane 2: HepG2, Lane 3: Huh7, Lane 4: SK-MEL-28