SREBP1 Antibody (Rabbit mAb) [J4J22] Datasheet

生物描述

特异性	SREBP1 Antibody (Rabbit mAb) [J4J22] 可检测内源性 SREBP1 总蛋白水平。
背景	SREBP-1 属于 SREBP 家族的膜结合碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子，以嵌入内质网膜的无活性前体形式合成，存在两种亚型，即 SREBP-1A 和 SREBP-1C，由不同的转录起始位点产生；SREBP-1A 选择性地在有限的组织中表达，并表现出更强的转录活性，能够驱动脂肪生成和胆固醇生成基因程序，而 SREBP-1C 是大多数组织中的主要亚型，具有较弱的转录活性，主要控制脂肪生成基因的表达。前体在内质网膜上与 SCAP（SREBP 裂解激活蛋白）结合，SCAP 是该调节系统的胆固醇感应成分。在甾醇充足的条件下，SCAP 通过其甾醇感应结构域与内质网驻留蛋白 INSIG-1 结合。这种 SCAP-INSIG 相互作用通过阻止 COPII 外壳蛋白识别胞质运输信号，将 SCAP-SREBP 复合物物理地保留在内质网内，从而阻止该复合物进入内质网到高尔基体的运输囊泡。当细胞甾醇水平下降时，甾醇诱导的 SCAP-INSIG 结合消失，释放出 SCAP-SREBP 复合物，使其离开内质网并进入高尔基体。在高尔基体中，SREBP-1 经历一个两步的、必须按顺序进行的蛋白水解激活：位点 1 蛋白酶首先在其腔内环内切割 SREBP-1，生成一个中间体，其中 N 端转录因子结构域仍锚定在膜上；然后位点 2 蛋白酶切割该中间体，将转录因子结构域完全从膜上释放出来；如果位点 1 切割尚未发生，位点 2 蛋白酶就不能作用于全长的 SREBP-1，这使得这两个蛋白水解步骤严格按顺序进行，而不是独立触发。释放的N端转录因子片段转位至细胞核，通过双重序列特异性结合靶基因启动子，识别经典的甾醇调节元件SRE-1和E-box基序，并驱动胆固醇生物合成、脂肪酸合成和低密度脂蛋白受体通路相关基因的转录。由于SCAP护送SREBP-1完成从内质网到高尔基体的转运步骤，并且是位点1蛋白酶进入SREBP-1所必需的，因此SCAP作为整个通路中受甾醇调控的限速检查点发挥作用。肝脏特异性敲除SCAP会消除所有SREBP亚型的加工，并显著降低肝脏脂质生成，这直接证实了SCAP是体内SREBP-1激活所必需的。 SREBP-1C 还能强烈激活快速增殖细胞中的全球脂质合成，并通过调节脂质代谢促进巨噬细胞的先天免疫反应，而 SREBP-1 加工失调与代谢性肝病有关。

特异性

SREBP1 Antibody (Rabbit mAb) [J4J22] 可检测内源性 SREBP1 总蛋白水平。

背景

SREBP-1 属于 SREBP 家族的膜结合碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子，以嵌入内质网膜的无活性前体形式合成，存在两种亚型，即 SREBP-1A 和 SREBP-1C，由不同的转录起始位点产生；SREBP-1A 选择性地在有限的组织中表达，并表现出更强的转录活性，能够驱动脂肪生成和胆固醇生成基因程序，而 SREBP-1C 是大多数组织中的主要亚型，具有较弱的转录活性，主要控制脂肪生成基因的表达。前体在内质网膜上与 SCAP（SREBP 裂解激活蛋白）结合，SCAP 是该调节系统的胆固醇感应成分。在甾醇充足的条件下，SCAP 通过其甾醇感应结构域与内质网驻留蛋白 INSIG-1 结合。这种 SCAP-INSIG 相互作用通过阻止 COPII 外壳蛋白识别胞质运输信号，将 SCAP-SREBP 复合物物理地保留在内质网内，从而阻止该复合物进入内质网到高尔基体的运输囊泡。当细胞甾醇水平下降时，甾醇诱导的 SCAP-INSIG 结合消失，释放出 SCAP-SREBP 复合物，使其离开内质网并进入高尔基体。在高尔基体中，SREBP-1 经历一个两步的、必须按顺序进行的蛋白水解激活：位点 1 蛋白酶首先在其腔内环内切割 SREBP-1，生成一个中间体，其中 N 端转录因子结构域仍锚定在膜上；然后位点 2 蛋白酶切割该中间体，将转录因子结构域完全从膜上释放出来；如果位点 1 切割尚未发生，位点 2 蛋白酶就不能作用于全长的 SREBP-1，这使得这两个蛋白水解步骤严格按顺序进行，而不是独立触发。释放的N端转录因子片段转位至细胞核，通过双重序列特异性结合靶基因启动子，识别经典的甾醇调节元件SRE-1和E-box基序，并驱动胆固醇生物合成、脂肪酸合成和低密度脂蛋白受体通路相关基因的转录。由于SCAP护送SREBP-1完成从内质网到高尔基体的转运步骤，并且是位点1蛋白酶进入SREBP-1所必需的，因此SCAP作为整个通路中受甾醇调控的限速检查点发挥作用。肝脏特异性敲除SCAP会消除所有SREBP亚型的加工，并显著降低肝脏脂质生成，这直接证实了SCAP是体内SREBP-1激活所必需的。 SREBP-1C 还能强烈激活快速增殖细胞中的全球脂质合成，并通过调节脂质代谢促进巨噬细胞的先天免疫反应，而 SREBP-1 加工失调与代谢性肝病有关。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

122 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

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