Stargazin Antibody (Rabbit mAb) [D18F22]

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生物描述

特异性

Stargazin Antibody (Rabbit mAb) [D18F22] 可检测内源性 Stargazin 总蛋白水平。
背景

Stargazin，又名TARP γ-2，是一种四次跨膜AMPA受体调节蛋白，作为神经元AMPA受体的辅助亚基，将生物合成运输、突触靶向和通道门控与谷氨酸能突触可塑性的活性依赖性形式相偶联。该蛋白具有一个小的胞外环和一个胞质C端尾部，后者包含PDZ结合基序和磷酸化基序。这种结构使其胞外结构域能够与AMPA受体配体结合域接触，而胞内尾部则与突触后支架蛋白（如PSD-95）以及控制受体运动和滞留的信号通路相互作用。星形蛋白与AMPA受体亚基的直接相互作用促进受体复合物从内质网释放，并递送至突触后表面并稳定存在。在星形蛋白突变小鼠中，这种相互作用的破坏会导致突触AMPA受体的严重丢失，而突触外受体则得以保留，这表明星形蛋白在突触区室选择性靶向中具有特异性作用。在功能上，星形蛋白通过减缓通道失活和脱敏以及加快通道开放速率来调节AMPA受体的门控，这些作用延长并增强了突触电流；胞质尾部主要控制转运和脱敏，而第一个胞外环对激动剂效力贡献更大，这表明星形蛋白的不同区域分别调节受体的动力学和定位。星形蛋白在神经元中的表达显著降低了谷氨酸诱发的脱敏作用，并大幅增强了对部分激动剂红藻氨酸的反应，这与一种变构相互作用相一致，该相互作用会破坏脱敏状态并增强不同AMPA受体亚基组成的门控效率。在突触处，星形蛋白通过其C端PDZ基序与PSD-95相互作用，使AMPA受体聚集并调节其突触滞留，而该尾部的磷酸化调节其与PSD-95的结合以及在膜上的侧向移动性，从而控制可塑性过程中AMPA受体的活动依赖性插入和移除。在小脑星状细胞中，星形蛋白是AMPA受体区室特异性转运和反映AMPA受体亚基组成变化的活动依赖性整流变化所必需的；星状细胞突变体表现出AMPA受体介导的突触传递显著减弱、整流指数降低和可塑性受损，而突触外AMPA受体仍然存在，这凸显了星状蛋白在突触特异性调控而非全局受体表达中的关键作用。星状蛋白还通过调节突触AMPA受体的内吞作用及其再循环/前向转运参与NMDA依赖性长时程抑制，使其成为双向转运通路的核心，这些通路能够响应特定的活动模式而减弱突触强度。最初的星形基因敲除小鼠表型——小脑共济失调和失神性癫痫——是由一种隐性突变引起的，该突变抑制了星形蛋白的表达，导致小脑突触处AMPA受体的丢失和突触后L型CaV1.2通道表达的减少。这表明星形蛋白协调AMPA受体-钙通道复合物的组装或转运，而这些复合物对于运动协调和节律性皮层-丘脑活动至关重要。星形蛋白的辅助亚基结构、明确的胞外结构域和尾部功能、在内质网输出、突触靶向、动力学调节以及小脑/高级脑回路可塑性中的作用，使其成为研究AMPA受体依赖性信号通路在学习、共济失调、癫痫及相关病理学中作用的机制丰富的靶点。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000-1:2000 1:30 1:1000
反应性 Rat, Mouse, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 36 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Mouse cerebral cortex