STEP Antibody [A7M19]

目录号：F5001

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生物描述

特异性 STEP Antibody [A7M19] 可检测内源性 STEP 总蛋白水平。
背景 STEP (PTPN5) 是一种在中枢神经系统富集的 ~37/46 kDa (STEP46 胞质/STEP61 膜结合) 酪氨酸特异性蛋白酪氨酸磷酸酶，对多巴胺能神经元信号传导至关重要，它能使包括 Fyn、Pyk2、ERK1/2 和谷氨酸受体 (NR2B GluN2B 亚基) 在内的底物去磷酸化，从而调节突触可塑性和 NMDAR/AMPA 受体运输。它具有保守的 PTP 催化结构域（STEP61 中的氨基酸 264-547，其中 Cys472 是催化 P 环特征 CWLCxxDR 基序中的亲核试剂）、调节激酶相互作用基序（KIM，氨基酸 183-201，结合 MAPK 停靠槽）、N 端肉豆蔻酰化/棕榈酰化位点（用于 STEP61 与膜结合）和抑制性磷酸化位点（STEP46 中的 Ser49，STEP61 中的 Ser221，位于 KIM 内，阻断底物接近）。其表现出活性依赖性去磷酸化，D1/PKA磷酸化使STEP失活（Ser221磷酸化增加，导致14-3-3结合和胞质隔离），而NMDA/Ca2+/钙调磷酸酶激活STEP61，使其去磷酸化以下位点：(1) Fyn Tyr420（激酶失活，导致LTP阻断），(2) ERK1/2 Thr202/Tyr204（终止MAPK信号传导），(3) GluN2B Tyr1472（诱导NMDAR内吞和LTD），以及(4) PTPα Tyr789（阻止突触转位和Fyn激活）。STEP敲除使基础酪氨酸磷酸化水平升高约1.5至2倍，从而增强LTP。 STEP蛋白维持纹状体稳态（平衡D1和D2受体信号传导）、元可塑性（双向调控长时程增强/长时程抑制）、空间记忆（海马CA1区）以及可卡因致敏，其在纹状体和新皮层中的表达最高。在阿尔茨海默病（Aβ寡聚体诱导Ser221磷酸化，导致ERK和Fyn活性病理性升高，进而驱动tau蛋白过度磷酸化）、精神分裂症和脆性X综合征（FMRP介导的过度表达导致突触发育不成熟）中，STEP蛋白表达上调或失活；STEP基因敲除可逆转阿尔茨海默病模型中的认知缺陷和磷酸化病理改变。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:50 1:100
反应性 Mouse, Rat
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 46 kDa, 61 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: fetal rat brain