STIM2 C-terminal Antibody (Rabbit mAb) [N9G10] Datasheet

生物描述

特异性	STIM2 C-terminal Antibody (Rabbit mAb) [N9G10] 可检测内源性 STIM2 C-terminal 总蛋白水平。
背景	STIM2是内质网钙传感器基质相互作用分子家族中STIM1的旁系同源物，与STIM1具有高度序列同源性，并保留了相同的整体结构域架构，包括感知内质网钙的腔内EF手结构域和无菌α基序、单个跨膜区段以及与质膜Orai1通道偶联的长胞质C端链。C端区域包含STIM-Orai激活区（SOAR），这是一个卷曲螺旋结构域，可直接与Orai1结合，并在胞内钙库耗竭时触发通道开放。STIM2中的SOAR结构域与Orai1的亲和力低于STIM1的相应区域，因此STIM2激活胞内钙库耗竭的钙离子通道的能力相对较弱且速度较慢。在C端更远处，STIM2携带一个富含赖氨酸的多碱性结构域，该结构域可与质膜上的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI4,5-P2）结合。与STIM1的相应区域相比，该结构域对含PI4,5-P2的膜具有更高的亲和力。这一特性使得含有STIM2的内质网小管更靠近质膜，并使该蛋白对内质网钙浓度的微小下降更为敏感。钙调蛋白与该C端多碱性结构域的结合依赖于钙离子和PI4,5-P2。钙调蛋白的结合会抑制该结构域与质膜脂质的相互作用，这意味着胞质钙离子浓度的升高会通过钙调蛋白反馈下调STIM2介导的内质网-质膜接触形成。 STIM2 具有与 STIM1 截然不同的功能特性：它包含一个低亲和力的 EF-hand 钙传感器、一个较弱的 Orai1 偶联 SOAR 结构域以及一个高亲和力的脂质结合多碱性区域。STIM2 的作用机制与 STIM1 不同：它不会像 STIM1 那样驱动与免疫细胞活化相关的大量快速钙内流，而是更接近于静息内质网钙水平，其主要功能是稳定胞质和内质网的钙基础浓度。这种基础调节作用延伸至突触环境，STIM2 介导的静息钙水平调控维持着突触的结构和稳定性，而这种调节功能的紊乱与阿尔茨海默病中观察到的钙稳态失衡密切相关。此外，STIM2 还通过一种不依赖于胞内钙库的模式发挥作用，该模式涉及与钙调蛋白的相互作用和解离，这使得该蛋白除了经典的胞内钙库耗竭机制外，还具有两种与下游钙通道偶联的不同模式。 STIM2 的腔内结构域也含有可进行亚硝化修饰的半胱氨酸残基，该区域的硫醇基稳定作用抑制了基础钙离子和储存操纵性钙离子的进入，表明氧化还原调节作为 STIM2 活性的额外控制层，不同于其 C 端 Orai1 和脂质偶联机制。

特异性

STIM2 C-terminal Antibody (Rabbit mAb) [N9G10] 可检测内源性 STIM2 C-terminal 总蛋白水平。

背景

STIM2是内质网钙传感器基质相互作用分子家族中STIM1的旁系同源物，与STIM1具有高度序列同源性，并保留了相同的整体结构域架构，包括感知内质网钙的腔内EF手结构域和无菌α基序、单个跨膜区段以及与质膜Orai1通道偶联的长胞质C端链。C端区域包含STIM-Orai激活区（SOAR），这是一个卷曲螺旋结构域，可直接与Orai1结合，并在胞内钙库耗竭时触发通道开放。STIM2中的SOAR结构域与Orai1的亲和力低于STIM1的相应区域，因此STIM2激活胞内钙库耗竭的钙离子通道的能力相对较弱且速度较慢。在C端更远处，STIM2携带一个富含赖氨酸的多碱性结构域，该结构域可与质膜上的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI4,5-P2）结合。与STIM1的相应区域相比，该结构域对含PI4,5-P2的膜具有更高的亲和力。这一特性使得含有STIM2的内质网小管更靠近质膜，并使该蛋白对内质网钙浓度的微小下降更为敏感。钙调蛋白与该C端多碱性结构域的结合依赖于钙离子和PI4,5-P2。钙调蛋白的结合会抑制该结构域与质膜脂质的相互作用，这意味着胞质钙离子浓度的升高会通过钙调蛋白反馈下调STIM2介导的内质网-质膜接触形成。 STIM2 具有与 STIM1 截然不同的功能特性：它包含一个低亲和力的 EF-hand 钙传感器、一个较弱的 Orai1 偶联 SOAR 结构域以及一个高亲和力的脂质结合多碱性区域。STIM2 的作用机制与 STIM1 不同：它不会像 STIM1 那样驱动与免疫细胞活化相关的大量快速钙内流，而是更接近于静息内质网钙水平，其主要功能是稳定胞质和内质网的钙基础浓度。这种基础调节作用延伸至突触环境，STIM2 介导的静息钙水平调控维持着突触的结构和稳定性，而这种调节功能的紊乱与阿尔茨海默病中观察到的钙稳态失衡密切相关。此外，STIM2 还通过一种不依赖于胞内钙库的模式发挥作用，该模式涉及与钙调蛋白的相互作用和解离，这使得该蛋白除了经典的胞内钙库耗竭机制外，还具有两种与下游钙通道偶联的不同模式。 STIM2 的腔内结构域也含有可进行亚硝化修饰的半胱氨酸残基，该区域的硫醇基稳定作用抑制了基础钙离子和储存操纵性钙离子的进入，表明氧化还原调节作为 STIM2 活性的额外控制层，不同于其 C 端 Orai1 和脂质偶联机制。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

84 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

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