TAB2 Antibody (Rabbit mAb) [E6J10] Datasheet

生物描述

特异性	TAB2 Antibody (Rabbit mAb) [E6J10] 可检测内源性 TAB2 总蛋白水平。
背景	TAB2（TAK1 结合蛋白 2/MAP3K7IP2）是 TAK1–TAB 支架家族的泛素结合衔接蛋白，它将受体下游产生的 Lys63 连接的多泛素信号与 MAP3K7/TAK1 的激活以及不同的 NF-κB、JNK 和非经典 Wnt 通路连接起来，同时还在生存信号传导和心脏稳态中发挥特定作用。该蛋白质包含一个 N 端 CUE/GLUE 样区域和卷曲螺旋片段，介导与 TAK1 和其他伙伴的结合，以及一个 C 端 RanBP2 型锌指 (NZF) 结构域，该结构域结合 Lys63 连接和混合 Lys63/Lys48 连接的多聚泛素链，这些多聚泛素链未锚定或连接到 RIPK1 和 RIPK2 等底物上，从而形成一个支架，将 TAK1 定位在泛素修饰的受体复合物附近，并促进 TAK1 的自身磷酸化。在IL-1或TNF家族配体刺激下，TAB2从细胞膜转位至胞质，并将含有TRAF6或RIPK的泛素平台与TAK1-TAB1连接起来，从而激活TAK1，并随后磷酸化驱动NF-κB和JNK信号通路的IKK核心复合物和MKK，进而将受体近端泛素化与控制炎症、细胞凋亡和增殖的转录反应相偶联。TAB2还能在Wnt信号通路中将TAK1与Nemo样激酶（NLK）连接起来；在这种情况下，TAB2相关的TAK1-NLK可磷酸化LEF1/TCF转录因子并抑制β-catenin依赖性转录，表明TAB2可以支持非经典Wnt信号通路，从而在发育和组织稳态过程中平衡经典Wnt信号通路。遗传和生化分析表明，TAB2并非所有TAK1依赖的NF-κB和MAPK激活所必需，它在TNF信号通路中发挥着额外的作用，尤其是在细胞毒性复合物II水平。TAB2通过NZF介导与泛素化组分结合，限制了凋亡和坏死性凋亡诱导复合物的丰度，并维持着一个独立于TAK1募集的促生存检查点。在心肌中，TAB2在维持心肌结构和功能方面起着至关重要的作用：小鼠心脏中TAB2的缺失会促进RIPK1依赖的凋亡和坏死性凋亡，放大炎症信号，并导致进行性扩张型心肌病。这表明，TAB2依赖的RIPK1复合物调控对于心肌稳态和应激下的重塑至关重要。在患有综合征性先天性心脏缺陷、成人发病型心肌病和结缔组织特征的家族中，杂合子TAB2变异体的存在与心脏发育和长期心室完整性对TAB2信号支架的剂量敏感性需求相一致。TAB2还与核受体共调节因子（如NCOR1和雌激素受体α）在乳腺癌细胞中相互作用，其中TAB2的特定中心结构域介导NCOR1从染色质上与拮抗剂结合的ERα上解离，并导致他莫昔芬耐药；竞争性肽破坏TAB2-ERα界面可恢复对他莫昔芬的抗增殖反应。

特异性

TAB2 Antibody (Rabbit mAb) [E6J10] 可检测内源性 TAB2 总蛋白水平。

背景

TAB2（TAK1 结合蛋白 2/MAP3K7IP2）是 TAK1–TAB 支架家族的泛素结合衔接蛋白，它将受体下游产生的 Lys63 连接的多泛素信号与 MAP3K7/TAK1 的激活以及不同的 NF-κB、JNK 和非经典 Wnt 通路连接起来，同时还在生存信号传导和心脏稳态中发挥特定作用。该蛋白质包含一个 N 端 CUE/GLUE 样区域和卷曲螺旋片段，介导与 TAK1 和其他伙伴的结合，以及一个 C 端 RanBP2 型锌指 (NZF) 结构域，该结构域结合 Lys63 连接和混合 Lys63/Lys48 连接的多聚泛素链，这些多聚泛素链未锚定或连接到 RIPK1 和 RIPK2 等底物上，从而形成一个支架，将 TAK1 定位在泛素修饰的受体复合物附近，并促进 TAK1 的自身磷酸化。在IL-1或TNF家族配体刺激下，TAB2从细胞膜转位至胞质，并将含有TRAF6或RIPK的泛素平台与TAK1-TAB1连接起来，从而激活TAK1，并随后磷酸化驱动NF-κB和JNK信号通路的IKK核心复合物和MKK，进而将受体近端泛素化与控制炎症、细胞凋亡和增殖的转录反应相偶联。TAB2还能在Wnt信号通路中将TAK1与Nemo样激酶（NLK）连接起来；在这种情况下，TAB2相关的TAK1-NLK可磷酸化LEF1/TCF转录因子并抑制β-catenin依赖性转录，表明TAB2可以支持非经典Wnt信号通路，从而在发育和组织稳态过程中平衡经典Wnt信号通路。遗传和生化分析表明，TAB2并非所有TAK1依赖的NF-κB和MAPK激活所必需，它在TNF信号通路中发挥着额外的作用，尤其是在细胞毒性复合物II水平。TAB2通过NZF介导与泛素化组分结合，限制了凋亡和坏死性凋亡诱导复合物的丰度，并维持着一个独立于TAK1募集的促生存检查点。在心肌中，TAB2在维持心肌结构和功能方面起着至关重要的作用：小鼠心脏中TAB2的缺失会促进RIPK1依赖的凋亡和坏死性凋亡，放大炎症信号，并导致进行性扩张型心肌病。这表明，TAB2依赖的RIPK1复合物调控对于心肌稳态和应激下的重塑至关重要。在患有综合征性先天性心脏缺陷、成人发病型心肌病和结缔组织特征的家族中，杂合子TAB2变异体的存在与心脏发育和长期心室完整性对TAB2信号支架的剂量敏感性需求相一致。TAB2还与核受体共调节因子（如NCOR1和雌激素受体α）在乳腺癌细胞中相互作用，其中TAB2的特定中心结构域介导NCOR1从染色质上与拮抗剂结合的ERα上解离，并导致他莫昔芬耐药；竞争性肽破坏TAB2-ERα界面可恢复对他莫昔芬的抗增殖反应。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:30

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

76 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: 293T, Lane 3: NIH/3T3, Lane 4: PC-12