Tachykinin-3 Antibody (Mouse mAb) [K4A12] Datasheet

生物描述

特异性	Tachykinin-3 Antibody (Mouse mAb) [K4A12] 可检测内源性 Tachykinin-3 总蛋白水平。
背景	速激肽-3由TAC3基因编码，以分泌型前体肽的形式合成，经蛋白水解加工生成神经激肽B。神经激肽B是保守的速激肽神经肽家族成员，其特征在于C端具有一个保守的共有基序，该基序赋予其对G蛋白偶联的神经激肽-3受体（NK3R）高亲和力和选择性，同时对其他速激肽受体的亲和力较低。成熟的速激肽主要在中枢和周围神经系统的特定神经元群中产生，包括控制促性腺激素释放激素（GnRH）分泌的下丘脑回路，这使得速激肽-3成为性腺功能和生殖神经内分泌输出的关键中枢调节因子。此外，在胎盘等外周组织中也有表达，并与妊娠相关的血管和高血压表型有关。速激肽-3与NK3R结合，激活Gq/11家族的异源三聚体G蛋白，进而刺激磷脂酶C，水解磷脂酰肌醇二磷酸，生成肌醇三磷酸和二酰甘油。肌醇三磷酸和二酰甘油反过来动员细胞内钙库并激活蛋白激酶C，从而为调节靶组织中的神经元兴奋性、神经递质释放和平滑肌收缩性提供了一条快速途径。这些近端信号与NK3R驱动的其他级联反应汇合，调节下游效应分子，例如L型钙通道和其他离子通道，从而支持强大的钙依赖性转录反应和突触整合。在这些回路中，速激肽-3-NK3R信号通路塑造着节律性促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲的产生、神经内分泌反馈和自主神经输出。速激肽-3 C端区域的结构决定因素，包括保守基序及其邻近的芳香族和带电残基，对于高亲和力识别NK3R以及区分受体亚型偏好至关重要。利用神经激肽B类似物进行的构效关系分析表明，特定的氨基酸替换可以显著增强NK3R的结合和激动剂效力，同时降低NK1R和NK2R的非靶向激活，这说明肽链的细微修饰如何影响受体偶联和信号强度。在表达NK3R的神经元中，持续的速激肽-3刺激不仅驱动经典的钙离子和蛋白激酶C（PKC）信号通路，还会激活通过组蛋白乙酰化重塑染色质的核程序，从而将该肽-受体对与基因表达的表观遗传调控联系起来，并提示重复或慢性激活可以持久地调节与神经元可塑性和神经内分泌状态相关的转录谱。生理上，速激肽-3信号通路参与下丘脑中kisspeptin和强啡肽网络输入信号的整合，从而影响促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲的时序和幅度、黄体生成素（LH）的释放以及下游性腺类固醇的生成。在外周器官中，相同的配体-受体模块参与平滑肌反应、血管舒张和分泌功能，进而影响血管张力和器官灌注。TAC3基因功能缺失突变或神经激肽B生成受损会导致正常嗅觉低促性腺激素性性腺功能减退症和不育，这凸显了完整的速激肽-3信号通路在人类生殖轴发育和维持中不可或缺的重要性。此外，胎盘组织中速激肽-3表达的改变与妊娠期高血压和子痫前期相关，这与其血管活性和内分泌调节特性相符。

特异性

Tachykinin-3 Antibody (Mouse mAb) [K4A12] 可检测内源性 Tachykinin-3 总蛋白水平。

背景

速激肽-3由TAC3基因编码，以分泌型前体肽的形式合成，经蛋白水解加工生成神经激肽B。神经激肽B是保守的速激肽神经肽家族成员，其特征在于C端具有一个保守的共有基序，该基序赋予其对G蛋白偶联的神经激肽-3受体（NK3R）高亲和力和选择性，同时对其他速激肽受体的亲和力较低。成熟的速激肽主要在中枢和周围神经系统的特定神经元群中产生，包括控制促性腺激素释放激素（GnRH）分泌的下丘脑回路，这使得速激肽-3成为性腺功能和生殖神经内分泌输出的关键中枢调节因子。此外，在胎盘等外周组织中也有表达，并与妊娠相关的血管和高血压表型有关。速激肽-3与NK3R结合，激活Gq/11家族的异源三聚体G蛋白，进而刺激磷脂酶C，水解磷脂酰肌醇二磷酸，生成肌醇三磷酸和二酰甘油。肌醇三磷酸和二酰甘油反过来动员细胞内钙库并激活蛋白激酶C，从而为调节靶组织中的神经元兴奋性、神经递质释放和平滑肌收缩性提供了一条快速途径。这些近端信号与NK3R驱动的其他级联反应汇合，调节下游效应分子，例如L型钙通道和其他离子通道，从而支持强大的钙依赖性转录反应和突触整合。在这些回路中，速激肽-3-NK3R信号通路塑造着节律性促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲的产生、神经内分泌反馈和自主神经输出。速激肽-3 C端区域的结构决定因素，包括保守基序及其邻近的芳香族和带电残基，对于高亲和力识别NK3R以及区分受体亚型偏好至关重要。利用神经激肽B类似物进行的构效关系分析表明，特定的氨基酸替换可以显著增强NK3R的结合和激动剂效力，同时降低NK1R和NK2R的非靶向激活，这说明肽链的细微修饰如何影响受体偶联和信号强度。在表达NK3R的神经元中，持续的速激肽-3刺激不仅驱动经典的钙离子和蛋白激酶C（PKC）信号通路，还会激活通过组蛋白乙酰化重塑染色质的核程序，从而将该肽-受体对与基因表达的表观遗传调控联系起来，并提示重复或慢性激活可以持久地调节与神经元可塑性和神经内分泌状态相关的转录谱。生理上，速激肽-3信号通路参与下丘脑中kisspeptin和强啡肽网络输入信号的整合，从而影响促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲的时序和幅度、黄体生成素（LH）的释放以及下游性腺类固醇的生成。在外周器官中，相同的配体-受体模块参与平滑肌反应、血管舒张和分泌功能，进而影响血管张力和器官灌注。TAC3基因功能缺失突变或神经激肽B生成受损会导致正常嗅觉低促性腺激素性性腺功能减退症和不育，这凸显了完整的速激肽-3信号通路在人类生殖轴发育和维持中不可或缺的重要性。此外，胎盘组织中速激肽-3表达的改变与妊娠期高血压和子痫前期相关，这与其血管活性和内分泌调节特性相符。

使用信息

抗体应用

WB, ELISA

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

13 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Recombinant Human TAC3 Protein