TAX1BP1 Antibody [B22F23] Datasheet

生物描述

特异性	TAX1BP1 Antibody [B22F23] 可检测内源性 TAX1BP1 总蛋白水平。
背景	TAX1BP1（Tax1结合蛋白1）是一种由约789个氨基酸组成的模块化适配器，最初被鉴定为HTLV-1 Tax相互作用蛋白。它具有N端SKICH结构域，用于在自噬起始中结合NAP1/RB1CC1；一个促进同源二聚化的中央卷曲螺旋/螺旋-环-螺旋区域；一个用于磷酸化调节的14-3-3基序；以及C端串联锌指（UBZ1/2）结构域，可特异性识别TRAF6、RIP1和TBK1等底物上的K63连接的泛素链。 TAX1BP1 在先天免疫中发挥着核心的负反馈作用，它作为泛素感应支架，在配体刺激下迅速将去泛素化酶 A20 (TNFAIP3) 募集到 TNFR/IL-1R 复合物中的多泛素化信号枢纽。IKKα 在 Ser593/Ser624 位点磷酸化 TAX1BP1 以触发这一组装，使 A20 的 OTU 结构域能够切割 K63-泛素，同时利用其 ZnF 结构域添加 K48-链，从而通过蛋白酶体降解 TRAF6/RIPK1，进而终止经典的 NF-κB 和 IRF3 激活，防止过度炎症；双 UBZ 结构域通过保守的精氨酸与近端泛素的 Ile44 斑块结合，从而以高亲和力结合二泛素。 TAX1BP1通过将泛素化的货物（聚集体、细菌、线粒体）连接到新生吞噬泡上来驱动选择性自噬；SKICH将RB1CC1/FIP200对接以募集ULK1复合物，并将NAP1/TBK1对接以促进磷酸化成熟；UBZ捕获底物，其C端基序结合LC3/GABARAP以包裹膜，从而促进异噬、线粒体自噬和聚集体自噬；肌球蛋白VI的相互作用有助于自噬体-内体融合。功能失调会促进自身免疫性疾病（例如，通过持续的NF-κB激活导致狼疮）、慢性炎症、神经退行性疾病（蛋白质清除受损）、肿瘤发生（IRF3/NF-κB失控）和病毒持续感染（例如，HTLV-1 Tax逃逸），并且在应激条件下，胞质定位会转移到细胞核。

特异性

TAX1BP1 Antibody [B22F23] 可检测内源性 TAX1BP1 总蛋白水平。

背景

TAX1BP1（Tax1结合蛋白1）是一种由约789个氨基酸组成的模块化适配器，最初被鉴定为HTLV-1 Tax相互作用蛋白。它具有N端SKICH结构域，用于在自噬起始中结合NAP1/RB1CC1；一个促进同源二聚化的中央卷曲螺旋/螺旋-环-螺旋区域；一个用于磷酸化调节的14-3-3基序；以及C端串联锌指（UBZ1/2）结构域，可特异性识别TRAF6、RIP1和TBK1等底物上的K63连接的泛素链。 TAX1BP1 在先天免疫中发挥着核心的负反馈作用，它作为泛素感应支架，在配体刺激下迅速将去泛素化酶 A20 (TNFAIP3) 募集到 TNFR/IL-1R 复合物中的多泛素化信号枢纽。IKKα 在 Ser593/Ser624 位点磷酸化 TAX1BP1 以触发这一组装，使 A20 的 OTU 结构域能够切割 K63-泛素，同时利用其 ZnF 结构域添加 K48-链，从而通过蛋白酶体降解 TRAF6/RIPK1，进而终止经典的 NF-κB 和 IRF3 激活，防止过度炎症；双 UBZ 结构域通过保守的精氨酸与近端泛素的 Ile44 斑块结合，从而以高亲和力结合二泛素。 TAX1BP1通过将泛素化的货物（聚集体、细菌、线粒体）连接到新生吞噬泡上来驱动选择性自噬；SKICH将RB1CC1/FIP200对接以募集ULK1复合物，并将NAP1/TBK1对接以促进磷酸化成熟；UBZ捕获底物，其C端基序结合LC3/GABARAP以包裹膜，从而促进异噬、线粒体自噬和聚集体自噬；肌球蛋白VI的相互作用有助于自噬体-内体融合。功能失调会促进自身免疫性疾病（例如，通过持续的NF-κB激活导致狼疮）、慢性炎症、神经退行性疾病（蛋白质清除受损）、肿瘤发生（IRF3/NF-κB失控）和病毒持续感染（例如，HTLV-1 Tax逃逸），并且在应激条件下，胞质定位会转移到细胞核。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

92 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: NCI-H226, Lane 2: U-937, Lane 3: Hela, Lane 4: HepG2