TAZ Antibody [G13C12]

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生物描述

特异性 TAZ Antibody [G13C12] 可检测内源性 TAZ 总蛋白水平。
背景 TAZ（含WW结构域的转录调节因子1，WWTR1）是一种与YAP密切相关的转录共激活因子，它整合Hippo信号通路、机械转导和代谢信号，从而调控细胞增殖、分化、器官大小和肿瘤发生。TAZ蛋白具有以下结构：N端WW结构域，可结合转录因子（Runx2、PPARγ、TEADs）上的PPxY基序；14-3-3结构域中的多个LATS1/2磷酸化位点（Ser89、Ser311、Ser314）；以及控制胞质隔离和蛋白酶体降解的β-TrCP降解子基序；介导蛋白相互作用（与Smad2/3）的中央卷曲螺旋结构域；以及C端PDZ结合基序和强转录激活结构域（氨基酸165-395），这些结构域对于核内聚集、共激活因子功能和基因诱导至关重要。从机制上讲，在高密度或 Hippo 激活状态下，LATS1/2 在多个位点磷酸化 TAZ，以促进 14-3-3 结合和胞质滞留，或 CK1 启动的 β-TrCP/SCF 介导的泛素化和周转；相反，在稀疏条件下、机械应力或 Hippo 抑制下，去磷酸化的 TAZ 易位到细胞核，其 WW 结构域与 TEAD1-4 结合，驱动促增殖/成肌基因（CTGF、CYR61、ANKRD1）或与 Runx2/PPARγ 结合，使间充质干细胞的命运倾向于成骨细胞/软骨细胞分化而不是脂肪细胞分化，同时其卷曲螺旋结构域与 TGF-β 诱导的 Smad2/3 结合，以维持多能性或纤维化程序，而 YAP/TAZ 异二聚体则增强 AP-1/TEAD 活性，促进组织再生和肿瘤发生。 LATS 缺失、上游 Hippo 突变或机械信号传导（通过整合素/FAK/肌动蛋白）引起的 TAZ 过度活跃驱动 YAP/TAZ-TEAD 依赖的肝癌、乳腺癌、肺癌和其他预后不良的癌症的肿瘤发生，而 TAZ 缺乏会损害组织修复、造血和机械敏感性分化。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, ChIP 稀释比例
WB IP IF CHIP
1:1000 1:50 1:100 - 1:400 1:50
反应性 Human, Mouse, Rat, Monkey
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 55 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: Hela, Lane 2: A204, Lane 3: H-4-II-E, Lane 4: COS-7