TAZ Antibody (Rabbit mAb) [B1F12]

目录号：F4150

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生物描述

特异性

TAZ/YAP Antibody (Rabbit mAb) [B1F12] 可检测内源性 TAZ 和 YAP 总蛋白水平。
背景

YAP 和 TAZ 是同源的转录共激活因子，它们作为 Hippo 信号级联的核心效应因子，整合机械信号、形态发生素信号和代谢信号，将细胞密度、极性、基质硬度和生长因子环境的变化转化为基因表达程序，从而控制器官生长、祖细胞扩增、组织稳态和肿瘤行为。在结构上，这两种蛋白均缺乏固有的 DNA 结合域，而是含有一个或多个 WW 结构域，这些结构域能够识别伴侣转录因子中的 PPxY 基序；此外，它们还包含一个卷曲螺旋区和一个 C 端 PDZ 结合基序，该基序支持与 TEAD1-4 和其他核伴侣的相互作用；YAP 还包含一个 SH3 结合基序和多个丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点，包括经典的 Hippo 位点，例如人 Ser127（小鼠 Ser112），这些位点决定了 YAP 的定位和稳定性。在经典的 Hippo 通路中，上游的 MST1/2–SAV1 和 MAP4Ks 激活 LATS1/2–MOB1 复合物，该复合物直接磷酸化 YAP 和 TAZ 的多个丝氨酸残基；这种磷酸化产生 14-3-3 结合位点，导致核外排斥和细胞质隔离，并使相邻的磷酸降解子准备被酪蛋白激酶 1δ/ε 进行二次磷酸化，从而导致 SCFβ-TrCP 介导的泛素化和蛋白酶体降解，因此激酶模块的激活最终导致 YAP/TAZ 依赖性转录的抑制。当Hippo信号通路活性较低时，YAP/TAZ会在细胞核内积累，并与TEAD转录因子以及其他伴侣蛋白（如AP-1）结合，作用于远端增强子和部分启动子区域。在这些区域，它们调节转录暂停的解除、H3K27乙酰化以及核小体的占据，从而驱动参与细胞周期进程、细胞存活、干性维持和上皮-间质转化（EMT）的基因表达，这些基因包括CTGF、CYR61、AREG、BCL-2以及其他生长和抗凋亡信号通路的调节因子。YAP和TAZ也作为组织力学和结构状态的主要传感器：它们的活性反映了细胞形状、黏附性和细胞骨架张力，并受Rho GTP酶、GPCR、甲羟戊酸途径活性和Wnt信号的调控。因此，细胞外基质硬度、细胞拥挤程度或细胞连接完整性的变化会改变Hippo激酶的活性，并直接影响YAP/TAZ的核定位和转录活性。在干细胞和祖细胞生物学中，YAP/TAZ在组织更新和再生过程中维持组织特异性祖细胞的扩增，并以依赖于特定环境的方式影响谱系决定；在间充质干细胞中，TAZ与Runx2和PPARγ相互作用，从而影响成骨和成脂分化；更广泛地说，YAP/TAZ与TEAD形成复合物，调控神经、肠道、肝脏和皮肤干细胞群的存活和自我更新。在癌症中，YAP/TAZ能够将分化的肿瘤细胞重编程为癌干细胞样细胞，通过上调促生存和促迁移基因以及重塑肿瘤微环境来促进转移并赋予肿瘤细胞化疗耐药性：肿瘤细胞和基质细胞中YAP/TAZ的激活增强纤维化和血管生成，调节免疫检查点和细胞因子产生，并改变固有免疫细胞的行为，这些共同促进肿瘤细胞的免疫逃逸和治疗耐药性。在免疫和炎症信号传导层面，YAP/TAZ 调控巨噬细胞和其他固有免疫细胞的功能。YAP/TAZ 活性失调会阻碍组织修复，导致慢性炎症和再生障碍，从而将组织重塑的机械化学信号与免疫细胞的转录程序联系起来。YAP 在细胞凋亡中也表现出情境依赖性作用：在许多癌症中，YAP/TAZ 通过增加 BCL-2 和减少 BAX 来减少细胞凋亡；而在 DNA 损伤条件下，YAP 可被 c-Abl 在 Tyr357 位点磷酸化，并使其结合的蛋白从 TEAD 转变为 p73，从而驱动促凋亡基因的表达和细胞死亡。这表明 YAP 对细胞存活的影响取决于上游信号传导状态和结合蛋白的组成。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000 1:100 1:50 - 1:200
反应性 Human, Mouse, Rat, Monkey
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 44 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: 293T, Lane 2: PANC-1, Lane 3: Hela, Lane 4: A204