TCF12/HEB Antibody [G2F21]

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生物描述

特异性 TCF12/HEB Antibody [G2F21] 可检测内源性 TCF12/HEB 总蛋白水平。
背景 TCF12/HEB（转录因子12/HeLa E-box结合蛋白）是一种I类E蛋白碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子，由位于15q21染色体上的TCF12基因编码，存在两种主要亚型：HEBCan（681个氨基酸，来自普遍存在的启动子）和HEBAlt（短形式，来自远端启动子）。这些亚型通过其保守的bHLH结构域与组织特异性bHLH伴侣（如E47、MyoD和NeuroD）形成异二聚体。该bHLH结构域包含一个碱性DNA结合区和一个用于二聚化的HLH基序，能够识别CANNTG E-box共有序列，从而驱动T/B细胞、肌肉和神经元的谱系分化。 TCF12/HEB包含一个富含酸性残基的N端激活结构域，用于募集共激活因子；一个含有谷氨酰胺/脯氨酸序列的中央转录激活结构域，可增强RNA聚合酶II的暂停和释放；一个核心bHLH结构域（约60个氨基酸残基），其中碱性螺旋与DNA大沟接触，而HLH两亲性螺旋则通过疏水界面二聚化；以及调节伴侣特异性的C端抑制结构域。外显子1的选择性剪接产生HEBCan（用于广泛的T细胞发育阶段）和HEBAlt（在DN2/DN3胸腺细胞中富集，以促进高效的前体细胞生成）。 TCF12/HEB 通过在 Eβ 和 Cd4 增强子处与 Lmo2 和 Lyl1 共结合来调控 T 细胞发育，从而激活参与重组和扩增的基因；通过竞争性二聚化抑制 E2A 靶基因以限制自我更新；并平衡造血干细胞 (HSC) 的重建与分化，其缺陷会导致髓系偏向、B/T 细胞阻滞和增殖缺陷。PKCθ/Carma1 信号通路在丝氨酸残基处磷酸化 HEBCan，解除 Id 蛋白介导的自身抑制，并使 TCR 诱导的染色质环化与 Runx1 和 Foxp1 结合，从而促进 Il2ra 和 Dtx1 的表达；而 HEBAlt 则特异性地与 Tcrα 增强子处的 Bcl11b 结合，促进阳性选择。TCF12 突变通过破坏 Twist1 异二聚化和颅缝通畅性导致冠状缝早闭（Saethre-Chotzen 综合征）。单倍体不足通过神经发育基因失调与阅读障碍有关，体细胞改变通过 EMT 和侵袭导致白血病（AML1-ETO 融合）或实体瘤进展。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000 1:50 1:200 - 1:800
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 85 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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