TDO2 Antibody [L23B14] Datasheet

生物描述

特异性	TDO2 Antibody [L23B14] 可检测内源性 TDO2 总蛋白水平。
背景	TDO2（色氨酸2,3-双加氧酶）由TDO2基因编码，是一种血红素依赖性同源四聚体酶，催化犬尿氨酸途径的初始限速步骤，将L-色氨酸氧化为N-甲酰犬尿氨酸（水解为犬尿氨酸），从而控制全身色氨酸的分解代谢，主要在肝脏中表达，在脑和肿瘤中可诱导表达。它由四个~47 kDa的亚基（每个亚基406个氨基酸）组成，以二聚体-二聚体的形式组装，具有全α螺旋折叠；每个单体都含有一个原卟啉IX血红素，该血红素通过近端His328在四螺旋束活性位点中进行双齿配位，底物对接由Arg144（极化吲哚）、Phe72/His76（疏水钳）和介导正协同性的N端环实现。TDO2通过Trp诱导的构象变化进行同源激活，这种构象变化在界面间传播，消耗局部Trp以抑制血清素/褪黑激素，同时将通量引导至NAD+生物合成和免疫调节犬尿氨酸。犬尿氨酸结合/二聚化AhR，将其转位以诱导IDO1、TGF-β、IL-10，从而导致T细胞无反应性、Treg扩增和M2巨噬细胞极化；从疾病角度来看，胶质瘤、乳腺癌和结直肠癌中 TDO2 的过度表达利用该轴逃避肿瘤免疫（与生存率低相关），而在神经退行性疾病（阿尔茨海默病、精神分裂症）中，过量的喹啉酸驱动 NMDA 介导的兴奋性毒性。

特异性

TDO2 Antibody [L23B14] 可检测内源性 TDO2 总蛋白水平。

背景

TDO2（色氨酸2,3-双加氧酶）由TDO2基因编码，是一种血红素依赖性同源四聚体酶，催化犬尿氨酸途径的初始限速步骤，将L-色氨酸氧化为N-甲酰犬尿氨酸（水解为犬尿氨酸），从而控制全身色氨酸的分解代谢，主要在肝脏中表达，在脑和肿瘤中可诱导表达。它由四个~47 kDa的亚基（每个亚基406个氨基酸）组成，以二聚体-二聚体的形式组装，具有全α螺旋折叠；每个单体都含有一个原卟啉IX血红素，该血红素通过近端His328在四螺旋束活性位点中进行双齿配位，底物对接由Arg144（极化吲哚）、Phe72/His76（疏水钳）和介导正协同性的N端环实现。TDO2通过Trp诱导的构象变化进行同源激活，这种构象变化在界面间传播，消耗局部Trp以抑制血清素/褪黑激素，同时将通量引导至NAD+生物合成和免疫调节犬尿氨酸。犬尿氨酸结合/二聚化AhR，将其转位以诱导IDO1、TGF-β、IL-10，从而导致T细胞无反应性、Treg扩增和M2巨噬细胞极化；从疾病角度来看，胶质瘤、乳腺癌和结直肠癌中 TDO2 的过度表达利用该轴逃避肿瘤免疫（与生存率低相关），而在神经退行性疾病（阿尔茨海默病、精神分裂症）中，过量的喹啉酸驱动 NMDA 介导的兴奋性毒性。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:2000

反应性

Human

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

47.7 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (human TDO2 transfected)