TDRD3 Antibody (Rabbit mAb) [C20J18] Datasheet

生物描述

特异性	TDRD3 Antibody (Rabbit mAb) [C20J18] 可检测内源性 TDRD3 总蛋白水平。
背景	TDRD3 是一种多结构域 Tudor 家族蛋白，其功能是识别不对称二甲基精氨酸标记，并将精氨酸甲基化与转录调控、R 环代谢和 RNA 应激反应区室联系起来。该蛋白包含一个 N 端泛素结合结构域、一个具有明确甲基精氨酸结合表面的中央 Tudor 结构域，以及其他低复杂度和核酸识别区域，这些区域支持蛋白质和 RNA 复合物的支架构建。Tudor 结构域识别组蛋白 H3 Arg17 和组蛋白 H4 Arg3 上的不对称二甲基精氨酸，这些标记主要由 PRMT1 写入并与转录激活相关。这种结合将 TDRD3 募集到启动子和增强子等存在精氨酸甲基化尾部的活性染色质区域。在这些位点，TDRD3 作为共激活因子，引入拓扑异构酶 IIIβ 和包括 DHX9 在内的其他因子，这些因子能够松弛负超螺旋 DNA 并解开高转录输出期间产生的 R 环，从而支持 DNA 的持续延伸并限制持久性 DNA-RNA 杂交体的暴露。TDRD3 Tudor 结构域与 DHX9 的直接相互作用引导 DHX9 定位到特定的启动子，而 TDRD3 的缺失会降低 DHX9 在染色质上的占位并增加启动子近端 R 环的积累，这表明甲基化组蛋白的读取和解旋酶的募集共同作用于转录基因的基因组稳定性维持，从而构成了一条明确的通路。TDRD3 还定位于翻译中的多核糖体，并在多种应激刺激下积累于细胞质应激颗粒中。在这些结构中，PRMT1通过其Tudor结构域与含二甲基精氨酸的RNA结合蛋白（包括G3BP1）结合，并通过增强RNA结合和提高驱动液-液相分离的蛋白质-RNA相互作用网络的价态来促进应激颗粒的组装。PRMT1甲基化RGG基序上的关键应激颗粒RNA结合蛋白（RBP），而TDRD3作为该甲基化标记读取器，因此PRMT1-TDRD3的协同作用调节应激颗粒形成的阈值和动态过程，并影响应激期间翻译停滞的mRNA的分配方式。

特异性

TDRD3 Antibody (Rabbit mAb) [C20J18] 可检测内源性 TDRD3 总蛋白水平。

背景

TDRD3 是一种多结构域 Tudor 家族蛋白，其功能是识别不对称二甲基精氨酸标记，并将精氨酸甲基化与转录调控、R 环代谢和 RNA 应激反应区室联系起来。该蛋白包含一个 N 端泛素结合结构域、一个具有明确甲基精氨酸结合表面的中央 Tudor 结构域，以及其他低复杂度和核酸识别区域，这些区域支持蛋白质和 RNA 复合物的支架构建。Tudor 结构域识别组蛋白 H3 Arg17 和组蛋白 H4 Arg3 上的不对称二甲基精氨酸，这些标记主要由 PRMT1 写入并与转录激活相关。这种结合将 TDRD3 募集到启动子和增强子等存在精氨酸甲基化尾部的活性染色质区域。在这些位点，TDRD3 作为共激活因子，引入拓扑异构酶 IIIβ 和包括 DHX9 在内的其他因子，这些因子能够松弛负超螺旋 DNA 并解开高转录输出期间产生的 R 环，从而支持 DNA 的持续延伸并限制持久性 DNA-RNA 杂交体的暴露。TDRD3 Tudor 结构域与 DHX9 的直接相互作用引导 DHX9 定位到特定的启动子，而 TDRD3 的缺失会降低 DHX9 在染色质上的占位并增加启动子近端 R 环的积累，这表明甲基化组蛋白的读取和解旋酶的募集共同作用于转录基因的基因组稳定性维持，从而构成了一条明确的通路。TDRD3 还定位于翻译中的多核糖体，并在多种应激刺激下积累于细胞质应激颗粒中。在这些结构中，PRMT1通过其Tudor结构域与含二甲基精氨酸的RNA结合蛋白（包括G3BP1）结合，并通过增强RNA结合和提高驱动液-液相分离的蛋白质-RNA相互作用网络的价态来促进应激颗粒的组装。PRMT1甲基化RGG基序上的关键应激颗粒RNA结合蛋白（RBP），而TDRD3作为该甲基化标记读取器，因此PRMT1-TDRD3的协同作用调节应激颗粒形成的阈值和动态过程，并影响应激期间翻译停滞的mRNA的分配方式。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

83 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: SH-SY5Y, Lane 2: 3T3, Lane 3: H-4-II-E, Lane 4: COS-7