TET2 Antibody (Rabbit mAb) [B6D15]

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生物描述

特异性 TET2 Antibody (Rabbit mAb) [B6D15] 可检测内源性 TET2 总蛋白水平。
背景 TET2 与 TET1 和 TET3 同属 Ten-Eleven 易位酶家族，该家族成员均为 Fe(II) 和 α-酮戊二酸依赖性双加氧酶。TET2 催化 DNA 上 5-甲基胞嘧啶的逐步氧化，首先生成 5-羟甲基胞嘧啶，然后进一步将该中间体氧化为 5-甲酰胞嘧啶和 5-羧基胞嘧啶。催化过程以分子氧为辅底物，促进 α-酮戊二酸的氧化脱羧，生成活性酶结合的 Fe(IV)-氧代中间体，该中间体随后驱动甲基化胞嘧啶碱基的羟基化。TET2 的活性依赖于氧气、α-酮戊二酸和抗坏血酸，其中抗坏血酸可增强该反应，因此 TET2 的活性与细胞代谢状态直接相关。 TET2 生成的氧化胞嘧啶衍生物，特别是 5-甲酰胞嘧啶和 5-羧基胞嘧啶，可被胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶直接识别并切除，从而将 TET2 催化的氧化与碱基切除修复途径联系起来，并完成了一条主动的、不依赖于复制的 DNA 去甲基化途径，而非细胞分裂过程中甲基标记的被动稀释。TET2 是造血组织中表达量最高的 TET 家族成员，尤其是在造血干细胞中，它促进启动子、增强子和沉默子元件的调控性去甲基化，这一过程对于调控细胞谱系分化、增殖和存活的转录控制以及维持造血干细胞衰老过程中的基因组完整性至关重要。除了其DNA氧化催化功能外，TET2还能将O-连接β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶募集到染色质上，从而将TET2活性与组蛋白翻译后修饰偶联起来，并提供了一种TET2独立于其核心双加氧酶活性影响基因表达的机制。将具有催化活性的TET2（而非催化失活的突变体）重新导入TET2缺陷的造血干细胞和祖细胞中，可以逆转TET2缺失所导致的自我更新增强和髓系分化异常，这直接证实了TET2抑制髓系恶性肿瘤的作用需要的是其双加氧酶活性本身，而非其支架蛋白功能。 TET2 功能丧失突变，以及代谢酶 IDH1/2 的突变（通过生成致癌代谢物 2-羟基戊二酸间接抑制 TET2 催化），是克隆性造血和骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤、急性髓系白血病和慢性粒单核细胞白血病中最常见的病变之一，导致区域性 DNA 高甲基化、正常分化受阻以及造血干细胞和祖细胞增殖优势，这些因素共同驱动克隆扩增。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:1000 1:50 1:400 - 1:1600 1:100
反应性 Mouse
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 212 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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