TET2 Antibody (Rabbit mAb) [H24A10] Datasheet

生物描述

特异性	TET2 Antibody (Rabbit mAb) [H24A10] 可检测内源性 TET2 总蛋白水平。
背景	TET2 是 Ten-Eleven Translocation 家族的 Fe²⁺/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶，可催化 DNA 中 5-甲基胞嘧啶逐步氧化为 5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和 5-羧基胞嘧啶，从而将 DNA 甲基化动态与碱基切除修复相耦合，并在造血细胞和其他干细胞和祖细胞中，在活性胞嘧啶去甲基化、增强子功能和谱系特异性基因调控中发挥核心作用。该蛋白质具有一个与非催化 CXXC4 结构域结合的 N 端区域和一个由富含半胱氨酸的片段和双链 β-螺旋折叠组成的 C 端催化模块，该折叠协调三个铁结合基序和一个 α-酮戊二酸结合位点，形成典型的 2-酮戊二酸加氧酶结构，将甲基化的胞嘧啶碱基定位在活性位点进行迭代氧化，使 TET2 能够在基因体和调控元件内的 CpG 位点生成 5hmC、5fC 和 5caC。全基因组和生化分析表明，TET2 在参与造血分化和免疫调节的增强子和富含 CpG 的启动子区域高度富集，其活性塑造 5hmC 的分布，并维持开放的染色质状态，从而允许细胞周期、凋亡、髓系和淋巴系谱系定向的关键调控因子的转录。TET2 功能丧失会导致启动子和 CpG 岛高甲基化，并降低分化相关基因的表达。在正常造血过程中，TET2 通过调节造血干细胞、祖细胞和生发中心 B 细胞中的增强子羟甲基化来抑制自我更新并促进成熟。 B细胞区室中条件性TET2缺陷会导致生发中心增生，损害浆细胞分化，并促进弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的发生，这表明TET2依赖性增强子去甲基化对于及时退出增殖微环境和维持体液免疫稳态至关重要。TET2体细胞功能缺失突变是髓系恶性肿瘤（包括骨髓增生异常综合征、克隆性造血和急性髓系白血病）中最常见的病变之一，并且在DLBCL等淋巴系肿瘤中也日益受到关注。整合甲基化-表达谱分析表明，TET2突变病例在造血分化基因的CpG岛和富含CpG的启动子区域表现出特征性的高甲基化，并伴有转录网络的失调。对弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）队列进行靶向测序，已发现TET2基因存在多种突变，包括无义突变、移码突变和错义突变，其突变频率在不同系列中高达约12%，尤其在老年EB病毒阳性DLBCL患者中突变率极高。在这些患者中，TET2和LILRB1是最常见的突变基因之一，提示TET2功能紊乱可能与病毒感染和免疫衰老协同作用，促进B细胞淋巴瘤的发生。除血液系统疾病外，前列腺癌、黑色素瘤和口腔鳞状细胞癌等多种实体瘤中也报道了TET2表达降低和5hmC水平升高。实验模型表明，TET2缺失通过将抑癌基因和分化基因锁定在高甲基化状态，并改变控制细胞增殖和侵袭的增强子图谱，从而促进致癌的表观遗传重编程。

特异性

TET2 Antibody (Rabbit mAb) [H24A10] 可检测内源性 TET2 总蛋白水平。

背景

TET2 是 Ten-Eleven Translocation 家族的 Fe²⁺/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶，可催化 DNA 中 5-甲基胞嘧啶逐步氧化为 5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和 5-羧基胞嘧啶，从而将 DNA 甲基化动态与碱基切除修复相耦合，并在造血细胞和其他干细胞和祖细胞中，在活性胞嘧啶去甲基化、增强子功能和谱系特异性基因调控中发挥核心作用。该蛋白质具有一个与非催化 CXXC4 结构域结合的 N 端区域和一个由富含半胱氨酸的片段和双链 β-螺旋折叠组成的 C 端催化模块，该折叠协调三个铁结合基序和一个 α-酮戊二酸结合位点，形成典型的 2-酮戊二酸加氧酶结构，将甲基化的胞嘧啶碱基定位在活性位点进行迭代氧化，使 TET2 能够在基因体和调控元件内的 CpG 位点生成 5hmC、5fC 和 5caC。全基因组和生化分析表明，TET2 在参与造血分化和免疫调节的增强子和富含 CpG 的启动子区域高度富集，其活性塑造 5hmC 的分布，并维持开放的染色质状态，从而允许细胞周期、凋亡、髓系和淋巴系谱系定向的关键调控因子的转录。TET2 功能丧失会导致启动子和 CpG 岛高甲基化，并降低分化相关基因的表达。在正常造血过程中，TET2 通过调节造血干细胞、祖细胞和生发中心 B 细胞中的增强子羟甲基化来抑制自我更新并促进成熟。 B细胞区室中条件性TET2缺陷会导致生发中心增生，损害浆细胞分化，并促进弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的发生，这表明TET2依赖性增强子去甲基化对于及时退出增殖微环境和维持体液免疫稳态至关重要。TET2体细胞功能缺失突变是髓系恶性肿瘤（包括骨髓增生异常综合征、克隆性造血和急性髓系白血病）中最常见的病变之一，并且在DLBCL等淋巴系肿瘤中也日益受到关注。整合甲基化-表达谱分析表明，TET2突变病例在造血分化基因的CpG岛和富含CpG的启动子区域表现出特征性的高甲基化，并伴有转录网络的失调。对弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）队列进行靶向测序，已发现TET2基因存在多种突变，包括无义突变、移码突变和错义突变，其突变频率在不同系列中高达约12%，尤其在老年EB病毒阳性DLBCL患者中突变率极高。在这些患者中，TET2和LILRB1是最常见的突变基因之一，提示TET2功能紊乱可能与病毒感染和免疫衰老协同作用，促进B细胞淋巴瘤的发生。除血液系统疾病外，前列腺癌、黑色素瘤和口腔鳞状细胞癌等多种实体瘤中也报道了TET2表达降低和5hmC水平升高。实验模型表明，TET2缺失通过将抑癌基因和分化基因锁定在高甲基化状态，并改变控制细胞增殖和侵袭的增强子图谱，从而促进致癌的表观遗传重编程。

使用信息

抗体应用

WB, ChIP

稀释比例

WB	ChIP
1:1000	1:50

反应性

Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

224 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 150s 以上)

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 150s 以上)

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (mTet2, transfected)