TGF β1 Antibody (Rabbit mAb) [N23L9] Datasheet

生物描述

特异性	TGF β1 Antibody (Rabbit mAb) [N23L9] 可检测内源性 TGF β1 总蛋白水平。
背景	TGF-β1属于转化生长因子-β超家族，是一类分泌型细胞因子。它以原蛋白的形式合成，经弗林蛋白酶切割成两条非共价结合的链：潜伏相关肽和成熟的TGF-β1。这两条链共同形成环状潜伏复合物，该复合物通过空间位阻效应保护生长因子免受受体结合。该潜伏复合物通过二硫键与潜伏TGF-β结合蛋白连接，锚定在细胞外基质中，使TGF-β1保持非活性、储存状态，直至接收到局部激活信号。激活过程需要αv整合素结合潜伏相关肽中的RGD基序，并对该结构域施加机械力。这一过程受到潜伏复合物在基质中的锚定作用的阻碍。这种力依赖性的解离作用使前结构域发生足够的形变，从而暴露成熟TGF-β1的受体结合表面，而无需将其完全从复合物中释放出来。一旦与TGF-β1结合，TGF-β1便会与组成型活性II型受体TGFBR2结合。TGFBR2募集I型受体TGFBR1，并使其近膜GS结构域内的丝氨酸残基发生磷酸化。活化的TGFBR1随后磷酸化SMAD2和SMAD3的两个C端丝氨酸残基，触发它们从受体复合物中解离，并与SMAD4结合形成异源复合物。该异源复合物转位至细胞核，调控TGF-β1靶基因的转录。SMAD2/3连接区和C端区域不同的磷酸化模式决定了下游信号传导是促进细胞抑制、促有丝分裂还是促纤维化转录，这使得该通路尽管具有共同的核心受体机制，却具有依赖于细胞环境的功能灵活性。由于激活仅限于整合素参与和机械力汇聚的部位，TGF-β1 信号传导尽管在组织水平上广泛表达，但仍保持高度局部性，这是控制骨形成、T 辅助细胞 17 与调节性 T 细胞谱系分化以及上皮间质转化的调节特征，其失调会导致纤维化和免疫相关疾病。

特异性

TGF β1 Antibody (Rabbit mAb) [N23L9] 可检测内源性 TGF β1 总蛋白水平。

背景

TGF-β1属于转化生长因子-β超家族，是一类分泌型细胞因子。它以原蛋白的形式合成，经弗林蛋白酶切割成两条非共价结合的链：潜伏相关肽和成熟的TGF-β1。这两条链共同形成环状潜伏复合物，该复合物通过空间位阻效应保护生长因子免受受体结合。该潜伏复合物通过二硫键与潜伏TGF-β结合蛋白连接，锚定在细胞外基质中，使TGF-β1保持非活性、储存状态，直至接收到局部激活信号。激活过程需要αv整合素结合潜伏相关肽中的RGD基序，并对该结构域施加机械力。这一过程受到潜伏复合物在基质中的锚定作用的阻碍。这种力依赖性的解离作用使前结构域发生足够的形变，从而暴露成熟TGF-β1的受体结合表面，而无需将其完全从复合物中释放出来。一旦与TGF-β1结合，TGF-β1便会与组成型活性II型受体TGFBR2结合。TGFBR2募集I型受体TGFBR1，并使其近膜GS结构域内的丝氨酸残基发生磷酸化。活化的TGFBR1随后磷酸化SMAD2和SMAD3的两个C端丝氨酸残基，触发它们从受体复合物中解离，并与SMAD4结合形成异源复合物。该异源复合物转位至细胞核，调控TGF-β1靶基因的转录。SMAD2/3连接区和C端区域不同的磷酸化模式决定了下游信号传导是促进细胞抑制、促有丝分裂还是促纤维化转录，这使得该通路尽管具有共同的核心受体机制，却具有依赖于细胞环境的功能灵活性。由于激活仅限于整合素参与和机械力汇聚的部位，TGF-β1 信号传导尽管在组织水平上广泛表达，但仍保持高度局部性，这是控制骨形成、T 辅助细胞 17 与调节性 T 细胞谱系分化以及上皮间质转化的调节特征，其失调会导致纤维化和免疫相关疾病。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:5000

反应性

Mouse, Rat, Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

44 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: K562, Lane 2: SH-SY5Y, Lane 3: L-929, Lane 4: Mouse spleen