TGIF Antibody [C15J1] Datasheet

生物描述

特异性	TGIF Antibody [C15J1] 可检测内源性 TGIF 总蛋白水平。
背景	TGIF1（同源框蛋白TGIF1，5'-TG-3'相互作用因子1）属于三氨基酸环延伸（TALE）同源结构域家族，是一类非典型的同源框转录因子，在胚胎发育和细胞分化过程中抑制基因表达。TGIF1由237个氨基酸组成，其中心TALE同源结构域（HD，氨基酸残基80-140）在螺旋1和螺旋2之间插入了三个氨基酸残基，使得TGIF1能够通过HD核心与DNA大沟的接触以及N端臂对DNA小沟的压缩来识别非典型的5'-TGACA-3' DNA基序。C端结构域（氨基酸残基150-237）介导蛋白质-蛋白质相互作用，其结构较为松散，能够灵活地与其他蛋白结合。 TGIF1 与 TGF-β/Nodal 信号通路激活的 Smad2-Smad4 复合物结合，其 HD 端结合 Smad MH1 结构域，通过空间位阻阻碍 DNA 的接近；而 C 端则与 Smad MH2 结构域结合，将复合物从启动子上置换下来，从而终止中内胚层和腹侧中线基因的转录。这种主动抑制作用通过拮抗 Nodal 诱导的 Shh 表达，在全前脑畸形 (HPE) 中分化前脑并形成腹侧结构模式。TGIF1 还抑制视黄酸反应元件（如 CRBPII-RXRE）上 RXRα 的转录激活，从而调节神经管闭合过程中的维生素 A 信号通路。在成体细胞中，TGIF1 通过隔离 Smad3 来抑制上皮-间质转化，并与 HDAC1/NCoR 协同作用，在分化过程中沉默多能性基因。 TGIF1杂合突变是1-4%全前脑畸形（HPE）病例的致病原因，其单倍体不足导致中线信号传导紊乱并上调淋巴结靶点，从而引起全前脑畸形。TGIF1过表达可通过上调Twist1促进乳腺癌侵袭，并通过EGFR通路促进神经胶质瘤增殖。TGIF1缺陷会损害胚状体中原条的形成和最终内胚层的分化。聚丙氨酸扩增会使该蛋白不稳定，从而导致更丰富的HPE表型。

特异性

TGIF Antibody [C15J1] 可检测内源性 TGIF 总蛋白水平。

背景

TGIF1（同源框蛋白TGIF1，5'-TG-3'相互作用因子1）属于三氨基酸环延伸（TALE）同源结构域家族，是一类非典型的同源框转录因子，在胚胎发育和细胞分化过程中抑制基因表达。TGIF1由237个氨基酸组成，其中心TALE同源结构域（HD，氨基酸残基80-140）在螺旋1和螺旋2之间插入了三个氨基酸残基，使得TGIF1能够通过HD核心与DNA大沟的接触以及N端臂对DNA小沟的压缩来识别非典型的5'-TGACA-3' DNA基序。C端结构域（氨基酸残基150-237）介导蛋白质-蛋白质相互作用，其结构较为松散，能够灵活地与其他蛋白结合。 TGIF1 与 TGF-β/Nodal 信号通路激活的 Smad2-Smad4 复合物结合，其 HD 端结合 Smad MH1 结构域，通过空间位阻阻碍 DNA 的接近；而 C 端则与 Smad MH2 结构域结合，将复合物从启动子上置换下来，从而终止中内胚层和腹侧中线基因的转录。这种主动抑制作用通过拮抗 Nodal 诱导的 Shh 表达，在全前脑畸形 (HPE) 中分化前脑并形成腹侧结构模式。TGIF1 还抑制视黄酸反应元件（如 CRBPII-RXRE）上 RXRα 的转录激活，从而调节神经管闭合过程中的维生素 A 信号通路。在成体细胞中，TGIF1 通过隔离 Smad3 来抑制上皮-间质转化，并与 HDAC1/NCoR 协同作用，在分化过程中沉默多能性基因。 TGIF1杂合突变是1-4%全前脑畸形（HPE）病例的致病原因，其单倍体不足导致中线信号传导紊乱并上调淋巴结靶点，从而引起全前脑畸形。TGIF1过表达可通过上调Twist1促进乳腺癌侵袭，并通过EGFR通路促进神经胶质瘤增殖。TGIF1缺陷会损害胚状体中原条的形成和最终内胚层的分化。聚丙氨酸扩增会使该蛋白不稳定，从而导致更丰富的HPE表型。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:5000	1:100

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

43 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: Hela, Lane 2: K562