Thioredoxin 2 Antibody [B17P21]

目录号：F5029

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生物描述

特异性 Thioredoxin 2 Antibody [B17P21] 可检测内源性 Thioredoxin 2 总蛋白水平。
背景 硫氧还蛋白2 (TRX2) 属于硫氧还蛋白家族，是一类小型氧化还原蛋白，主要定位于线粒体基质。该蛋白由166个氨基酸残基组成，具有经典的硫氧还蛋白折叠结构，中央为五链β折叠（β1-β5），两侧各有一条α螺旋（α1-α4）。活性位点-Cys69-Pro72-Cys73-基序位于α2螺旋的N端，暴露于底物结合位点。Cys69-Cys73之间的二硫键通过亲核攻击还原氧化的靶蛋白，并在硫氧还蛋白还原酶2 (TRXR2) 和NADPH的作用下再生还原态的TRX2。 N端Cys73周围的疏水相互作用介导的二聚化调节其活性，而N端线粒体靶向序列（氨基酸残基1-55）则指导其导入和切割。TRX2通过还原过氧化物酶PRX3/PRX5来清除线粒体活性氧（ROS），从而防止呼吸作用或缺血引起的氧化应激过程中蛋白质羰基化和脂质过氧化。它通过维持电子传递链复合物I-IV和乌头酸酶的完整性来维持线粒体的完整性，防止细胞色素c的释放。还原态的TRX2通过活性位点的硫醇基团与凋亡信号调节激酶1（ASK1）结合，抑制其寡聚化和MAPK/JNK/p38的激活，从而阻断内源性凋亡。在H₂O₂或缺氧条件下，氧化作用会使TRX2-ASK1解离，从而激活caspase级联反应。在蛋白质折叠过程中，TRX2 辅助蛋白质二硫键异构酶 PDIA4 修复错误折叠的链间二硫键。心磷脂氧化修复通过 TRX2-PRXR3 进行，从而保护嵴结构。TRX2 敲除会导致胚胎在 E9 阶段死亡，并伴有扩张型心肌病、神经管缺陷以及由活性氧 (ROS) 过载引起的广泛细胞凋亡。心脏特异性缺失会导致生物能量学受损，从而在压力过载下引发心力衰竭。癌细胞会上调 TRX2 以逃避氧化应激诱导的细胞死亡，从而促进增殖；抑制 TRX2 可与阿霉素等 ROS 诱导剂产生协同作用。弗里德赖希共济失调的特征是 TRX2 缺陷加剧了弗拉塔辛蛋白的丢失和铁硫簇的损伤。肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和帕金森病中 ASK1 抑制受损与神经退行性疾病相关。慢性 TRX2 水平下降会加速衰老，并增加线粒体 DNA (mtDNA) 突变。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Human, Mouse, Rat, Hamster, Monkey
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 13 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Hela, Lane 2: MOLT-4, Lane 3: Nruro-2a, Lane 4: COS-7