Thrombospondin 1 Antibody [N18C17] Datasheet

生物描述

特异性	Thrombospondin 1 Antibody [N18C17] 可检测内源性 Thrombospondin 1 总蛋白水平。
背景	血小板反应蛋白-1 (TSP-1 或 THBS1) 是一种同源三聚体基质细胞糖蛋白，由血小板、内皮细胞和成纤维细胞分泌，并整合到细胞外基质中，通过与多种配体相互作用来调节组织重塑。TSP-1 由一个 N 端球状 TSPN 结构域组成，该结构域形成一个由 13 条反平行 β 折叠链构成的 β-三明治结构，具有独特的非规则 β4′ 片段，并在 Cys248 位点形成二硫键，使其能够与肝素、聚集蛋白聚糖和整合素 αvβ3 结合。随后是血管性血友病因子C结构域、三个I型重复序列（TSR），其特征是堆叠的色氨酸/精氨酸梯状结构和保守的WXXWCSXG基序，这些基序介导与CD36和CD47的结合并抑制MMP2/9；EGF样II型重复序列；以及15个钙调蛋白同源重复序列，最后一个重复序列中的RGD基序赋予其对整合素αvβ3和αIIbβ3的亲和力。该蛋白以C端凝集素样球状结构域结尾，该结构域结合蛋白聚糖并通过Cys252和Cys256处的链间二硫键稳定寡聚体。TSP-1通过聚集CD47有效抑制血管生成，从而通过募集SHP-2磷酸酶和阻断eNOS的S-亚硝基化来破坏VEGF-R2和一氧化氮（NO）信号通路。 TSP-1还能通过整合素αvβ3/β8介导的剪切力依赖性潜伏相关肽的展开激活潜伏的TGF-β1，进而导致Smad2/3磷酸化和纤维化。它通过caspase-8/3级联反应和Fyn/FAK抑制诱导内皮细胞和平滑肌细胞发生失巢凋亡和CD36介导的细胞凋亡，同时又矛盾地促进白细胞通过钙网蛋白/LRP1/CD91介导的对凋亡小体或病原体的吞噬作用进行跨内皮迁移和吞噬。TSP-1缺陷会加剧乳腺癌和前列腺癌模型中的肿瘤发生，导致病理性血管生成和免疫逃逸，而其3TSR片段在ADAMTS1裂解后释放时具有很强的抗血管生成活性。

特异性

Thrombospondin 1 Antibody [N18C17] 可检测内源性 Thrombospondin 1 总蛋白水平。

背景

血小板反应蛋白-1 (TSP-1 或 THBS1) 是一种同源三聚体基质细胞糖蛋白，由血小板、内皮细胞和成纤维细胞分泌，并整合到细胞外基质中，通过与多种配体相互作用来调节组织重塑。TSP-1 由一个 N 端球状 TSPN 结构域组成，该结构域形成一个由 13 条反平行 β 折叠链构成的 β-三明治结构，具有独特的非规则 β4′ 片段，并在 Cys248 位点形成二硫键，使其能够与肝素、聚集蛋白聚糖和整合素 αvβ3 结合。随后是血管性血友病因子C结构域、三个I型重复序列（TSR），其特征是堆叠的色氨酸/精氨酸梯状结构和保守的WXXWCSXG基序，这些基序介导与CD36和CD47的结合并抑制MMP2/9；EGF样II型重复序列；以及15个钙调蛋白同源重复序列，最后一个重复序列中的RGD基序赋予其对整合素αvβ3和αIIbβ3的亲和力。该蛋白以C端凝集素样球状结构域结尾，该结构域结合蛋白聚糖并通过Cys252和Cys256处的链间二硫键稳定寡聚体。TSP-1通过聚集CD47有效抑制血管生成，从而通过募集SHP-2磷酸酶和阻断eNOS的S-亚硝基化来破坏VEGF-R2和一氧化氮（NO）信号通路。 TSP-1还能通过整合素αvβ3/β8介导的剪切力依赖性潜伏相关肽的展开激活潜伏的TGF-β1，进而导致Smad2/3磷酸化和纤维化。它通过caspase-8/3级联反应和Fyn/FAK抑制诱导内皮细胞和平滑肌细胞发生失巢凋亡和CD36介导的细胞凋亡，同时又矛盾地促进白细胞通过钙网蛋白/LRP1/CD91介导的对凋亡小体或病原体的吞噬作用进行跨内皮迁移和吞噬。TSP-1缺陷会加剧乳腺癌和前列腺癌模型中的肿瘤发生，导致病理性血管生成和免疫逃逸，而其3TSR片段在ADAMTS1裂解后释放时具有很强的抗血管生成活性。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

170 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: ACHN, Lane 2: LN18, Lane 3: MEF