Tie2 Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	Tie2 Rabbit mAb 检测内源性 Tie2 总的蛋白水平。
背景	Tie2 是一种酪氨酸蛋白激酶受体，主要存在于血管内皮细胞中，对维持血管系统稳定性至关重要。在人类中，Tie2 与三种已知配体相互作用：血管生成素-1 (Ang1)、血管生成素-2 (Ang2) 和血管生成素-4 (Ang4)，所有这些配体都以相似的亲和力与 Tie2 结合。Ang1 通过刺激其激酶活性来激活 Tie2，而 Ang2 主要充当 Ang1 的拮抗因子，尽管在某些情况下它可以作为部分激动因子发挥作用。此外，Ang2 可能在特定条件下促进血管生成。Ang4 可以影响 Ang1 介导的信号传导并表现出抗菌特性。Tie2 信号通路补充 VEGF 通路，特别是在血管发育的后期阶段。Ang1 通过激活 PI3K-Akt1 信号通路促进内皮细胞存活，这一功能也可以通过Ang2 浓度较高。这种信号级联促进 eNOS 磷酸化、一氧化氮 (NO) 生成和血管生成。Tie2 由人类的 TEK 基因编码，在肺组织和眼部 Schlemm 管内皮细胞中表达水平较高，表明其与哮喘和眼部疾病（包括过敏性结膜炎）等疾病有关。下游信号分子如 Grb2、Grb7、Grb14、SHP-2、磷脂酰肌醇 3-激酶的 p85 亚基和 p56/Dok-2 通过 SH2 或 PTB 结构域以磷酸酪氨酸依赖的方式与 Tie2 相互作用，进一步传播其信号转导。

特异性

Tie2 Rabbit mAb 检测内源性 Tie2 总的蛋白水平。

背景

Tie2 是一种酪氨酸蛋白激酶受体，主要存在于血管内皮细胞中，对维持血管系统稳定性至关重要。在人类中，Tie2 与三种已知配体相互作用：血管生成素-1 (Ang1)、血管生成素-2 (Ang2) 和血管生成素-4 (Ang4)，所有这些配体都以相似的亲和力与 Tie2 结合。Ang1 通过刺激其激酶活性来激活 Tie2，而 Ang2 主要充当 Ang1 的拮抗因子，尽管在某些情况下它可以作为部分激动因子发挥作用。此外，Ang2 可能在特定条件下促进血管生成。Ang4 可以影响 Ang1 介导的信号传导并表现出抗菌特性。Tie2 信号通路补充 VEGF 通路，特别是在血管发育的后期阶段。Ang1 通过激活 PI3K-Akt1 信号通路促进内皮细胞存活，这一功能也可以通过Ang2 浓度较高。这种信号级联促进 eNOS 磷酸化、一氧化氮 (NO) 生成和血管生成。Tie2 由人类的 TEK 基因编码，在肺组织和眼部 Schlemm 管内皮细胞中表达水平较高，表明其与哮喘和眼部疾病（包括过敏性结膜炎）等疾病有关。下游信号分子如 Grb2、Grb7、Grb14、SHP-2、磷脂酰肌醇 3-激酶的 p85 亚基和 p56/Dok-2 通过 SH2 或 PTB 结构域以磷酸酪氨酸依赖的方式与 Tie2 相互作用，进一步传播其信号转导。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit

MW

160 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

文献参考

[1] Gal Z, et al. Front Genet. 2020 Feb 27:11:128.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HUVEC
Lane 2: HMVEC