Toll-like Receptor 2 Antibody [M20D11] Datasheet

生物描述

特异性	Toll-like Receptor 2 Antibody [M20D11] 可检测内源性 Toll-like Receptor 2 总蛋白水平。
背景	Toll样受体2（TLR2）是TLR家族模式识别受体中的一种I型跨膜糖蛋白，主要作为巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞细胞表面微生物成分的哨兵。它通过与TLR1（识别三酰化脂肽）或TLR6（识别二酰化脂肽）形成异二聚体，识别多种病原体相关分子模式（PAMPs），二者共同构成M形配体结合平台。TLR2的胞外结构域呈马蹄形，由10个富含亮氨酸的重复序列（LRR11-20）组成，这些重复序列形成连续的β折叠和由二硫键稳定的凸形支架，其后是跨膜螺旋和约150个氨基酸的胞质Toll/IL-1受体（TIR）结构域。 TIR结构域包含一个BB环，其中Pro681和His686对于MyD88衔接蛋白的对接至关重要。配体诱导的二聚化后，TIR发生寡聚化，使两个TIR之间的距离缩短至约5纳米。TLR2通过配体结合，Pam3CSK4和Pam2CSK4占据LRR上的疏水区域，触发受体构象转换，并通过TIR-TIR界面募集TIRAP和MyD88衔接蛋白。这激活了IRAK4、IRAK1和TRAF6，进而激活TAK1和IKKβ/NF-κB信号通路，诱导TNFα、IL-6和IL-12等促炎细胞因子的产生，以及通过p38、JNK和ERK1/2激活MAPK信号通路，并产生抗菌反应，同时促进吞噬作用和内体成熟。 TLR2阳性单核细胞通过ICAM-1上调增强内皮细胞黏附和迁移，且该过程独立于炎症。TLR2通过促进树突状细胞成熟和CD4+ T细胞启动，连接先天免疫和适应性免疫；通过Treg细胞扩增和Pam3CSK4介导的对IL-2抑制的抵抗，增强免疫耐受；并通过响应内源性配体（如HMGB1）在无菌性炎症中维持体内平衡。TLR2过度激活与脓毒性休克和动脉粥样硬化相关，其中oxLDL或Pam3CSK4等刺激物促进泡沫细胞形成；而TLR2缺陷则会损害机体对曲霉菌和念珠菌的抗真菌免疫。

特异性

Toll-like Receptor 2 Antibody [M20D11] 可检测内源性 Toll-like Receptor 2 总蛋白水平。

背景

Toll样受体2（TLR2）是TLR家族模式识别受体中的一种I型跨膜糖蛋白，主要作为巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞细胞表面微生物成分的哨兵。它通过与TLR1（识别三酰化脂肽）或TLR6（识别二酰化脂肽）形成异二聚体，识别多种病原体相关分子模式（PAMPs），二者共同构成M形配体结合平台。TLR2的胞外结构域呈马蹄形，由10个富含亮氨酸的重复序列（LRR11-20）组成，这些重复序列形成连续的β折叠和由二硫键稳定的凸形支架，其后是跨膜螺旋和约150个氨基酸的胞质Toll/IL-1受体（TIR）结构域。 TIR结构域包含一个BB环，其中Pro681和His686对于MyD88衔接蛋白的对接至关重要。配体诱导的二聚化后，TIR发生寡聚化，使两个TIR之间的距离缩短至约5纳米。TLR2通过配体结合，Pam3CSK4和Pam2CSK4占据LRR上的疏水区域，触发受体构象转换，并通过TIR-TIR界面募集TIRAP和MyD88衔接蛋白。这激活了IRAK4、IRAK1和TRAF6，进而激活TAK1和IKKβ/NF-κB信号通路，诱导TNFα、IL-6和IL-12等促炎细胞因子的产生，以及通过p38、JNK和ERK1/2激活MAPK信号通路，并产生抗菌反应，同时促进吞噬作用和内体成熟。 TLR2阳性单核细胞通过ICAM-1上调增强内皮细胞黏附和迁移，且该过程独立于炎症。TLR2通过促进树突状细胞成熟和CD4+ T细胞启动，连接先天免疫和适应性免疫；通过Treg细胞扩增和Pam3CSK4介导的对IL-2抑制的抵抗，增强免疫耐受；并通过响应内源性配体（如HMGB1）在无菌性炎症中维持体内平衡。TLR2过度激活与脓毒性休克和动脉粥样硬化相关，其中oxLDL或Pam3CSK4等刺激物促进泡沫细胞形成；而TLR2缺陷则会损害机体对曲霉菌和念珠菌的抗真菌免疫。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

85-100 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: RAW264.7, Lane 2: BMDC