Toll-like Receptor 4 Antibody (Rabbit mAb) [D2G12] Datasheet

生物描述

特异性	Toll-like Receptor 4 Antibody (Rabbit mAb) [D2G12] 可检测内源性 Toll-like Receptor 4 总蛋白水平。
背景	Toll样受体4 (TLR4)，又称CD284，是Toll样受体家族的模式识别受体，能够感知质膜和内体隔室中的病原体相关分子模式和损伤相关分子模式，从而为针对革兰氏阴性菌和无菌性损伤的先天免疫激活提供主要触发因素。该受体具有一个大的胞外富含亮氨酸重复序列结构域，该结构域与脂多糖 (LPS) 结合，并与共受体MD-2和辅助蛋白CD14形成复合物；此外，该受体还包含一个跨膜螺旋和一个胞内TIR结构域，该结构域与下游衔接蛋白结合，组装信号复合物。LPS结合蛋白将单体LPS转移至CD14，CD14再将LPS递送至TLR4-MD-2胞外结构域； LPS与MD-2-TLR4复合物结合后诱导其同源二聚化，并使胞内TIR结构域彼此靠近，从而形成一个募集衔接分子的支架。在质膜上，TIRAP（Mal）和MyD88被募集到活化的TIR结构域，形成以MyD88为模板的“myddosome”，该复合物与IRAK激酶和TRAF6结合，进而激活IKK复合物，导致IκB磷酸化和降解，以及NF-κB的核转位，同时激活包括p38、ERK和JNK在内的MAPK通路。这一MyD88依赖性通路驱动促炎细胞因子、趋化因子和共刺激分子的早期转录，从而建立快速的炎症和免疫启动反应。初始信号传导后，TLR4 被内吞至早期内体，其中 TRAM 和 TRIF 作为分选衔接蛋白，组装成一个独特的 TRIF 依赖性复合物，该复合物激活 TBK1 和 IKKε，磷酸化 IRF3，并诱导 I 型干扰素和干扰素刺激基因的表达，从而为 TLR4 信号通路赋予抗病毒和免疫调节功能，该功能在空间上与质膜促炎输出相分离。聚集的 TLR4-MyD88 复合物模板形成螺旋状的 myddosome，并定位 TRAF3 和 TRAF6。TRAF3 和 TRAF6 在 MyD88 上的部分重叠结合位点整合了抗病毒/抗炎（TRAF3）和促炎（TRAF6）输出，突显了 TLR4 通路分支是如何在衔接蛋白和信号体水平上编码的。 TLR4不仅识别LPS，还能识别内源性危险配体，例如HMGB1、热休克蛋白和氧化脂蛋白。这些损伤相关分子模式（DAMPs）与TLR4的结合会导致非感染性炎症，例如动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行性疾病和组织损伤。在脓毒症中，极低浓度的内毒素-MD-2复合物足以驱动强烈的TLR4依赖性细胞活化，而不受控制的MyD88和TRIF信号通路会放大细胞因子风暴和凝血途径，使TLR4成为脓毒症病理生理学中的核心节点，也是阻断LPS-MD-2-TLR4相互作用或下游衔接蛋白募集的拮抗剂的靶点。在动脉粥样硬化和血管疾病中，内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞上表达的 TLR4 对修饰的脂蛋白和其他内源性配体作出反应，促进 NF-κB 驱动的粘附分子、趋化因子和基质降解酶的表达，从而支持斑块的形成和不稳定性。

特异性

Toll-like Receptor 4 Antibody (Rabbit mAb) [D2G12] 可检测内源性 Toll-like Receptor 4 总蛋白水平。

背景

Toll样受体4 (TLR4)，又称CD284，是Toll样受体家族的模式识别受体，能够感知质膜和内体隔室中的病原体相关分子模式和损伤相关分子模式，从而为针对革兰氏阴性菌和无菌性损伤的先天免疫激活提供主要触发因素。该受体具有一个大的胞外富含亮氨酸重复序列结构域，该结构域与脂多糖 (LPS) 结合，并与共受体MD-2和辅助蛋白CD14形成复合物；此外，该受体还包含一个跨膜螺旋和一个胞内TIR结构域，该结构域与下游衔接蛋白结合，组装信号复合物。LPS结合蛋白将单体LPS转移至CD14，CD14再将LPS递送至TLR4-MD-2胞外结构域； LPS与MD-2-TLR4复合物结合后诱导其同源二聚化，并使胞内TIR结构域彼此靠近，从而形成一个募集衔接分子的支架。在质膜上，TIRAP（Mal）和MyD88被募集到活化的TIR结构域，形成以MyD88为模板的“myddosome”，该复合物与IRAK激酶和TRAF6结合，进而激活IKK复合物，导致IκB磷酸化和降解，以及NF-κB的核转位，同时激活包括p38、ERK和JNK在内的MAPK通路。这一MyD88依赖性通路驱动促炎细胞因子、趋化因子和共刺激分子的早期转录，从而建立快速的炎症和免疫启动反应。初始信号传导后，TLR4 被内吞至早期内体，其中 TRAM 和 TRIF 作为分选衔接蛋白，组装成一个独特的 TRIF 依赖性复合物，该复合物激活 TBK1 和 IKKε，磷酸化 IRF3，并诱导 I 型干扰素和干扰素刺激基因的表达，从而为 TLR4 信号通路赋予抗病毒和免疫调节功能，该功能在空间上与质膜促炎输出相分离。聚集的 TLR4-MyD88 复合物模板形成螺旋状的 myddosome，并定位 TRAF3 和 TRAF6。TRAF3 和 TRAF6 在 MyD88 上的部分重叠结合位点整合了抗病毒/抗炎（TRAF3）和促炎（TRAF6）输出，突显了 TLR4 通路分支是如何在衔接蛋白和信号体水平上编码的。 TLR4不仅识别LPS，还能识别内源性危险配体，例如HMGB1、热休克蛋白和氧化脂蛋白。这些损伤相关分子模式（DAMPs）与TLR4的结合会导致非感染性炎症，例如动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行性疾病和组织损伤。在脓毒症中，极低浓度的内毒素-MD-2复合物足以驱动强烈的TLR4依赖性细胞活化，而不受控制的MyD88和TRIF信号通路会放大细胞因子风暴和凝血途径，使TLR4成为脓毒症病理生理学中的核心节点，也是阻断LPS-MD-2-TLR4相互作用或下游衔接蛋白募集的拮抗剂的靶点。在动脉粥样硬化和血管疾病中，内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞上表达的 TLR4 对修饰的脂蛋白和其他内源性配体作出反应，促进 NF-κB 驱动的粘附分子、趋化因子和基质降解酶的表达，从而支持斑块的形成和不稳定性。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

96 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: 3T3