TORC1 Antibody [B21M7] Datasheet

生物描述

特异性	TORC1 Antibody [B21M7] 可检测内源性 TORC1 总蛋白水平。
背景	雷帕霉素靶蛋白复合物 1 (TORC1) 是一个核心的多蛋白激酶复合物，它整合各种信号，例如营养物质、能量和生长因子的可及性，从而调节生长、代谢和自噬等关键细胞过程。TORC1 由丝氨酸/苏氨酸激酶 mTOR 和多种调节蛋白组成，包括 mTOR 的调节相关蛋白 (Raptor)、哺乳动物致死蛋白 SEC13 蛋白 8 (mLST8)、PRAS40 和 DEPTOR。这些成分形成一个二聚化的菱形复合物，其中 mTOR 和 Raptor 在二聚化和底物募集过程中发挥关键作用。 TORC1通过磷酸化下游靶点（例如核糖体蛋白S6激酶1 (S6K1) 和真核翻译起始因子4E结合蛋白1 (4E-BP1)）来驱动细胞合成代谢过程，促进蛋白质合成、脂质生物合成和核苷酸合成，这些对于细胞生长和增殖都至关重要。TORC1还通过磷酸化ULK1来抑制自噬，从而平衡合成代谢和分解代谢途径，维持细胞稳态。TORC1的活性受到严格调控，其氨基酸可用性由Rag GTPases和Ragulator复合物感知，这两者将TORC1定位到溶酶体表面进行活化。此外，生长因子通过PI3K-Akt-TSC-Rheb通路激活TORC1，而能量应激则通过AMP活化蛋白激酶 (AMPK) 介导的TSC2磷酸化抑制TORC1。 PRAS40是TORC1的内源性抑制剂，其抑制作用在磷酸化后被解除。雷帕霉素可通过与FKBP12和mTOR的FRB结构域结合，从而破坏复合物的活性，在药理学上抑制TORC1。TORC1的过度激活通常与各种癌症、代谢紊乱和年龄相关疾病有关。

特异性

TORC1 Antibody [B21M7] 可检测内源性 TORC1 总蛋白水平。

背景

雷帕霉素靶蛋白复合物 1 (TORC1) 是一个核心的多蛋白激酶复合物，它整合各种信号，例如营养物质、能量和生长因子的可及性，从而调节生长、代谢和自噬等关键细胞过程。TORC1 由丝氨酸/苏氨酸激酶 mTOR 和多种调节蛋白组成，包括 mTOR 的调节相关蛋白 (Raptor)、哺乳动物致死蛋白 SEC13 蛋白 8 (mLST8)、PRAS40 和 DEPTOR。这些成分形成一个二聚化的菱形复合物，其中 mTOR 和 Raptor 在二聚化和底物募集过程中发挥关键作用。 TORC1通过磷酸化下游靶点（例如核糖体蛋白S6激酶1 (S6K1) 和真核翻译起始因子4E结合蛋白1 (4E-BP1)）来驱动细胞合成代谢过程，促进蛋白质合成、脂质生物合成和核苷酸合成，这些对于细胞生长和增殖都至关重要。TORC1还通过磷酸化ULK1来抑制自噬，从而平衡合成代谢和分解代谢途径，维持细胞稳态。TORC1的活性受到严格调控，其氨基酸可用性由Rag GTPases和Ragulator复合物感知，这两者将TORC1定位到溶酶体表面进行活化。此外，生长因子通过PI3K-Akt-TSC-Rheb通路激活TORC1，而能量应激则通过AMP活化蛋白激酶 (AMPK) 介导的TSC2磷酸化抑制TORC1。 PRAS40是TORC1的内源性抑制剂，其抑制作用在磷酸化后被解除。雷帕霉素可通过与FKBP12和mTOR的FRB结构域结合，从而破坏复合物的活性，在药理学上抑制TORC1。TORC1的过度激活通常与各种癌症、代谢紊乱和年龄相关疾病有关。

使用信息

抗体应用

WB, FCM

稀释比例

WB	FCM
1:1000 - 1:5000	1:1000 - 1:10000

反应性

Rat, Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

67 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain