TRAF3 Antibody (Rabbit mAb) [E9G8] Datasheet

生物描述

特异性	TRAF3 Antibody (Rabbit mAb) [E9G8] 可检测内源性 TRAF3 总蛋白水平。
背景	TRAF3 属于 TNF 受体相关因子家族的胞质衔接蛋白，该家族将 TNF 受体超家族成员与下游信号级联偶联。TRAF3 作为非经典 NF-κB 通路的核心负调控因子发挥作用。非经典 NF-κB 通路与经典 NF-κB 激活的不同之处在于，它依赖于前体蛋白 p100 的诱导加工，而不是 IκBα 的降解。在未受刺激的情况下，新合成的 NF-κB 诱导激酶 NIK 立即与 TRAF3 结合，TRAF3 将其募集到一个多亚基 E3 泛素连接酶复合物中。该复合物由 TRAF3 与 TRAF2 以及相关的泛素连接酶 cIAP1 和 cIAP2 二聚化组装而成。在该复合物中，cIAP1/2催化NIK的K48连接泛素化，使其持续被蛋白酶体降解，从而在静息细胞中保持非经典NF-κB信号通路关闭。当配体（例如CD40或BAFF）与受体结合时，TRAF2、TRAF3和cIAP1/2会被募集到受体复合物中。TRAF2可能通过受体诱导的聚集而被激活，并介导cIAP1/2的K63连接泛素化。这种修饰会激活cIAP1/2的K48特异性连接酶活性，使其作用于TRAF3而非NIK。这种重定向的连接酶活性导致TRAF3发生K48连接的泛素化和蛋白酶体降解。由于TRAF3是NIK递送至降解复合物所必需的，其缺失使得新合成的NIK能够逃脱降解并积累。此时，NIK磷酸化IKKα，IKKα进而磷酸化p100，触发p100的泛素化、部分蛋白酶体加工生成p52，以及p52-RelB NF-κB二聚体的核转位。TRAF2和TRAF3在该泛素化级联反应中发挥着不可替代的互补作用。TRAF3作为直接募集NIK的衔接蛋白，而TRAF2则作为连接TRAF3和cIAP连接酶的桥梁。cIAP1和cIAP2的功能相互冗余，因为同时抑制二者才能触发非经典NF-κB激活。小鼠TRAF3缺陷会导致死亡，而同时缺失NIK可以挽救这种死亡，这直接表明，导致TRAF3缺失的病理后果的驱动因素是NIK的过度积累，而非TRAF3功能的普遍丧失。影响TRAF3-TRAF2-cIAP破坏复合物的基因缺陷或NIK基因本身的扩增与异常的非经典NF-κB激活和B细胞恶性肿瘤（尤其是多发性骨髓瘤）相关，这表明TRAF3是一个明确的检查点，其在B淋巴细胞中的功能丧失会将一种受到严格抑制的激酶转化为NF-κB依赖性B细胞存活和增殖信号的组成型活性驱动因子。

特异性

TRAF3 Antibody (Rabbit mAb) [E9G8] 可检测内源性 TRAF3 总蛋白水平。

背景

TRAF3 属于 TNF 受体相关因子家族的胞质衔接蛋白，该家族将 TNF 受体超家族成员与下游信号级联偶联。TRAF3 作为非经典 NF-κB 通路的核心负调控因子发挥作用。非经典 NF-κB 通路与经典 NF-κB 激活的不同之处在于，它依赖于前体蛋白 p100 的诱导加工，而不是 IκBα 的降解。在未受刺激的情况下，新合成的 NF-κB 诱导激酶 NIK 立即与 TRAF3 结合，TRAF3 将其募集到一个多亚基 E3 泛素连接酶复合物中。该复合物由 TRAF3 与 TRAF2 以及相关的泛素连接酶 cIAP1 和 cIAP2 二聚化组装而成。在该复合物中，cIAP1/2催化NIK的K48连接泛素化，使其持续被蛋白酶体降解，从而在静息细胞中保持非经典NF-κB信号通路关闭。当配体（例如CD40或BAFF）与受体结合时，TRAF2、TRAF3和cIAP1/2会被募集到受体复合物中。TRAF2可能通过受体诱导的聚集而被激活，并介导cIAP1/2的K63连接泛素化。这种修饰会激活cIAP1/2的K48特异性连接酶活性，使其作用于TRAF3而非NIK。这种重定向的连接酶活性导致TRAF3发生K48连接的泛素化和蛋白酶体降解。由于TRAF3是NIK递送至降解复合物所必需的，其缺失使得新合成的NIK能够逃脱降解并积累。此时，NIK磷酸化IKKα，IKKα进而磷酸化p100，触发p100的泛素化、部分蛋白酶体加工生成p52，以及p52-RelB NF-κB二聚体的核转位。TRAF2和TRAF3在该泛素化级联反应中发挥着不可替代的互补作用。TRAF3作为直接募集NIK的衔接蛋白，而TRAF2则作为连接TRAF3和cIAP连接酶的桥梁。cIAP1和cIAP2的功能相互冗余，因为同时抑制二者才能触发非经典NF-κB激活。小鼠TRAF3缺陷会导致死亡，而同时缺失NIK可以挽救这种死亡，这直接表明，导致TRAF3缺失的病理后果的驱动因素是NIK的过度积累，而非TRAF3功能的普遍丧失。影响TRAF3-TRAF2-cIAP破坏复合物的基因缺陷或NIK基因本身的扩增与异常的非经典NF-κB激活和B细胞恶性肿瘤（尤其是多发性骨髓瘤）相关，这表明TRAF3是一个明确的检查点，其在B淋巴细胞中的功能丧失会将一种受到严格抑制的激酶转化为NF-κB依赖性B细胞存活和增殖信号的组成型活性驱动因子。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Mouse, Rat, Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

64 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293T, Lane 2: NIH/3T3, Lane 3: RAW264.7, Lane 4: Mouse brain