TRAF5 Antibody [C3D23]

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生物描述

特异性 TRAF5 Antibody [C3D23] 可检测内源性 TRAF5 总蛋白水平。
背景 TRAF5 是一种 TNF 受体相关因子家族衔接蛋白，它组装多个 TNF 受体超家族成员下游的信号复合物，参与淋巴细胞和髓系细胞中 NF-κB 和 MAPK 信号通路的激活和调控。该蛋白包含一个 N 端 RING 样锌指结构域和卷曲螺旋结构域，支持寡聚化和 E3 连接酶相关功能；以及一个 C 端 TRAF 结构域，该结构域由 TRAF-N 卷曲螺旋和 TRAF-C β-三明治结构组成，介导三聚化和受体或衔接蛋白结合，使 TRAF5 三聚体能够与 CD27、CD30、CD40、4-1BB 和 GITR 等共刺激 TNFR 家族受体的胞内尾部对接。这些受体的激活会募集TRAF5（通常与TRAF2一起）进入膜近端复合物。在复合物中，TRAF5与上游衔接蛋白和泛素连接酶结合，并帮助组装Lys-63连接的多聚泛素支架，从而促进TAK1和IKK复合物的募集和激活，最终导致IκB的磷酸化和降解以及NF-κB的核转位，并激活JNK和p38 MAPK。TRAF5也是IL-17A信号通路中的一个效应分子，它与衔接蛋白Act1结合并调节IL-17受体相关复合物。生化分析表明，TRAF5的Lys-63连接的多聚泛素化是IL-17诱导的NF-κB最佳激活和RORγt依赖性炎症基因（包括与Th17驱动的自身免疫相关的基因）表达所必需的。 TRAF5在淋巴细胞共刺激信号传导中发挥正向调节作用，这已通过缺乏Traf5的小鼠得到证实。这些小鼠表现出细胞内信号传导受损，并且在通过CD27、CD30和4-1BB等受体进行共刺激后，增殖或存活率降低。这些受体与抗原受体通路协同作用，调节B细胞和T细胞的反应。TRAF5多态性会增加类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病的易感性。TRAF5功能的改变，尤其是在滑膜成纤维细胞和Th17细胞中，会改变IL-6等细胞因子的产生，从而将TRAF5整合到调节慢性关节炎症和自身免疫病理的分子网络中。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
WB IF
1:1000 1:50
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 64 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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