TRAF6 Antibody [B8B10] Datasheet

生物描述

特异性	TRAF6 Antibody [B8B10] 可检测内源性 TRAF6 总蛋白水平。该抗体预测不会与其他 TRAF 家族成员发生交叉反应。
背景	肿瘤坏死因子受体相关因子 (TRAF) 构成一个胞质衔接蛋白家族，介导多种细胞内信号转导事件。在哺乳动物中，已鉴定出 7 个 TRAF 家族成员，包括 6 个经典成员 (TRAF1–TRAF6) 和 1 个非经典成员 (TRAF7)。经典 TRAF 共享一个保守的羧基末端 TRAF 结构域，而非经典 TRAF7 则不存在该结构域。功能上，TRAF 参与肿瘤坏死因子超家族 (TNFSF) 以及 Toll 样/IL-1 受体 (TLR/ILR) 超家族成员的信号转导，从而调节下游信号级联，例如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路。除受体信号转导外，TRAF 在细胞增殖、分化、凋亡和存活中发挥重要作用，同时还调节免疫和炎症反应。 TRAF蛋白失调会导致肿瘤发生，其不同成员发挥致癌或抑癌功能。TRAF1、TRAF2、TRAF4、TRAF5和TRAF6已被证明与致癌作用有关，而TRAF3主要发挥抑癌作用。在该家族中，TRAF6以其独特的受体结合特异性而著称，这使其不仅能与TNF受体超家族成员相互作用，还能与IL-1R/TLR超家族蛋白相互作用。据报道，TRAF6在多种肿瘤类型中均存在过表达，包括结肠癌、胃癌、乳腺癌以及黑色素瘤。功能上，TRAF6通过调节细胞凋亡、增殖、存活和侵袭来促进肿瘤的发生和发展。机制上，TRAF6激活多条信号通路，其中Toll样受体4 (TLR4)级联反应尤为重要。 TRAF6 通过 MyD88 依赖性和非 MyD88 非依赖性途径放大炎症和生存信号。此外，TRAF6 通过促进 PI3K 泛素化来增强 PI3K-AKT 通路的激活，从而增加 AKT 磷酸化并促进细胞生长。总而言之，这些发现强调了 TRAF6 是整合受体信号转导与致癌过程的关键衔接蛋白。

特异性

TRAF6 Antibody [B8B10] 可检测内源性 TRAF6 总蛋白水平。该抗体预测不会与其他 TRAF 家族成员发生交叉反应。

背景

肿瘤坏死因子受体相关因子 (TRAF) 构成一个胞质衔接蛋白家族，介导多种细胞内信号转导事件。在哺乳动物中，已鉴定出 7 个 TRAF 家族成员，包括 6 个经典成员 (TRAF1–TRAF6) 和 1 个非经典成员 (TRAF7)。经典 TRAF 共享一个保守的羧基末端 TRAF 结构域，而非经典 TRAF7 则不存在该结构域。功能上，TRAF 参与肿瘤坏死因子超家族 (TNFSF) 以及 Toll 样/IL-1 受体 (TLR/ILR) 超家族成员的信号转导，从而调节下游信号级联，例如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路。除受体信号转导外，TRAF 在细胞增殖、分化、凋亡和存活中发挥重要作用，同时还调节免疫和炎症反应。 TRAF蛋白失调会导致肿瘤发生，其不同成员发挥致癌或抑癌功能。TRAF1、TRAF2、TRAF4、TRAF5和TRAF6已被证明与致癌作用有关，而TRAF3主要发挥抑癌作用。在该家族中，TRAF6以其独特的受体结合特异性而著称，这使其不仅能与TNF受体超家族成员相互作用，还能与IL-1R/TLR超家族蛋白相互作用。据报道，TRAF6在多种肿瘤类型中均存在过表达，包括结肠癌、胃癌、乳腺癌以及黑色素瘤。功能上，TRAF6通过调节细胞凋亡、增殖、存活和侵袭来促进肿瘤的发生和发展。机制上，TRAF6激活多条信号通路，其中Toll样受体4 (TLR4)级联反应尤为重要。 TRAF6 通过 MyD88 依赖性和非 MyD88 非依赖性途径放大炎症和生存信号。此外，TRAF6 通过促进 PI3K 泛素化来增强 PI3K-AKT 通路的激活，从而增加 AKT 磷酸化并促进细胞生长。总而言之，这些发现强调了 TRAF6 是整合受体信号转导与致癌过程的关键衔接蛋白。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

60 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Li J, et al. Cancer Cell Int. 2020 Sep 3:20:429.

Application Data

WB

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Lane 1: K562, Lane 2: Hela, Lane 3: 293T, Lane 4: COS-7