TREM2 Antibody (Rabbit mAb) [F18K20]

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生物描述

特异性 TREM2 Antibody (Rabbit mAb) [F18K20] 可检测内源性 TREM2 总蛋白水平。
背景 TREM2（髓系细胞表达的触发受体2）是TREM家族的I型跨膜免疫受体，在中枢神经系统的小胶质细胞以及外周髓系细胞上高表达且具有选择性。它作为一种脂质和损伤相关的模式识别受体，将细胞外对载脂蛋白、磷脂和淀粉样蛋白的感知与细胞内DAP12-SYK-PI3K信号通路偶联，从而控制小胶质细胞的存活、代谢、趋化性和吞噬作用。该受体包含一个N端V型Ig样胞外结构域，可结合包括ApoE、ApoJ/CLU、阴离子和氨基磷脂以及多种形式的β-淀粉样蛋白在内的配体；一个与含ITAM的衔接蛋白DAP12结合的单次跨膜区段；以及一个依赖DAP12进行信号传导的短胞质尾。 H157/S158位点的胞外结构域脱落产生具有独特信号传导特性的可溶性TREM2片段。配体结合可稳定TREM2-DAP12复合物，促进DAP12 ITAM的磷酸化，募集并激活SYK，进而激活下游的PI3K-AKT-mTOR、ERK和PLCγ通路。这些作用共同增强小胶质细胞的存活、增殖和代谢重编程，驱动趋化反应，使其趋向淀粉样蛋白沉积或受损髓鞘，并诱导小胶质细胞从稳态向疾病相关状态的转录转换，其特征是参与吞噬作用、脂质代谢、溶酶体功能和补体相关基因的上调。 TREM2 促进小胶质细胞在斑块周围聚集，使淀粉样蛋白核心致密化，并有效吞噬清除 Aβ 聚集体和营养不良性神经突。而 TREM2 缺陷或低活性变体的表达会减少小胶质细胞增殖和斑块包裹，导致斑块形态更加弥散且具有神经毒性，加剧神经突损伤，并加速淀粉样蛋白沉积和 tau 蛋白的播散。TREM2 中的罕见错义变异（例如 R47H）和功能缺失突变会显著增加晚发性阿尔茨海默病的风险，并在双等位基因突变时导致纳苏-哈科拉病。机制分析表明，这些变异会降低配体结合和/或表面表达，抑制 DAP12-SYK 信号通路，并损害疾病相关小胶质细胞表型的获得，而这种表型对于有效控制 Aβ 和 tau 病理至关重要。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:1000 1:50 1:200 - 1:800 1:400
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 28 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: THP-1