TRIM5α Antibody [E3H20] Datasheet

生物描述

特异性	TRIM5α Antibody [E3H20] 可检测内源性 TRIM5α 总蛋白水平。
背景	TRIM5α属于三方基序（TRIM）蛋白家族，其特征在于N端RING结构域（具有E3泛素连接酶活性）、B-box结构域和介导寡聚化的卷曲螺旋区，以及负责特异性配体识别的C端B30.2/SPRY结构域。卷曲螺旋结构域能够组装成与逆转录病毒衣壳表面对称性相匹配的六边形晶格，而SPRY结构域则以物种差异的方式直接与病毒衣壳晶格上的决定簇结合，例如，恒河猴TRIM5α对HIV-1衣壳具有高亲和力，而人TRIM5α则更倾向于N嗜性鼠白血病病毒衣壳。 TRIM5α通过SPRY结构域与完整的逆转录病毒核心结合后，加速病毒衣壳的过早脱壳，将颗粒状衣壳转化为胞质溶胶中的可溶性形式，而无需依赖蛋白酶体降解或对衣壳蛋白进行主要的共价修饰，从而干扰逆转录之前的早期进入后事件。同时，TRIM5α与UBC13/UEV1A异二聚体E2泛素结合酶结合，通过其RING结构域合成游离的、未连接的K63连接的多聚泛素链，这些多聚泛素链与TAB2/3结合，触发TAK1激酶复合物在苏氨酸187位点的自身磷酸化，进而激活下游的AP-1和NF-κB转录因子，驱动炎症细胞因子和趋化因子的表达。这种双重机制整合了逆转录病毒限制和先天免疫感知，其中衣壳格架相互作用增强泛素链的产生，信号传导效力与TRIM5α与衣壳的结合亲和力成正比，从而在受到限制敏感性逆转录病毒攻击时增强IL-6、IL-8、CXCL10和PTGS2等介质的产生。TRIM5α在髓系细胞中发挥作用，限制多种逆转录病毒，包括旧世界猴的HIV-1和人类的MLV毒株，从而导致物种特异性病毒嗜性，并通过TAK1依赖性通路增强由病原体相关模式（如LPS）诱导的抗病毒状态。

特异性

TRIM5α Antibody [E3H20] 可检测内源性 TRIM5α 总蛋白水平。

背景

TRIM5α属于三方基序（TRIM）蛋白家族，其特征在于N端RING结构域（具有E3泛素连接酶活性）、B-box结构域和介导寡聚化的卷曲螺旋区，以及负责特异性配体识别的C端B30.2/SPRY结构域。卷曲螺旋结构域能够组装成与逆转录病毒衣壳表面对称性相匹配的六边形晶格，而SPRY结构域则以物种差异的方式直接与病毒衣壳晶格上的决定簇结合，例如，恒河猴TRIM5α对HIV-1衣壳具有高亲和力，而人TRIM5α则更倾向于N嗜性鼠白血病病毒衣壳。 TRIM5α通过SPRY结构域与完整的逆转录病毒核心结合后，加速病毒衣壳的过早脱壳，将颗粒状衣壳转化为胞质溶胶中的可溶性形式，而无需依赖蛋白酶体降解或对衣壳蛋白进行主要的共价修饰，从而干扰逆转录之前的早期进入后事件。同时，TRIM5α与UBC13/UEV1A异二聚体E2泛素结合酶结合，通过其RING结构域合成游离的、未连接的K63连接的多聚泛素链，这些多聚泛素链与TAB2/3结合，触发TAK1激酶复合物在苏氨酸187位点的自身磷酸化，进而激活下游的AP-1和NF-κB转录因子，驱动炎症细胞因子和趋化因子的表达。这种双重机制整合了逆转录病毒限制和先天免疫感知，其中衣壳格架相互作用增强泛素链的产生，信号传导效力与TRIM5α与衣壳的结合亲和力成正比，从而在受到限制敏感性逆转录病毒攻击时增强IL-6、IL-8、CXCL10和PTGS2等介质的产生。TRIM5α在髓系细胞中发挥作用，限制多种逆转录病毒，包括旧世界猴的HIV-1和人类的MLV毒株，从而导致物种特异性病毒嗜性，并通过TAK1依赖性通路增强由病原体相关模式（如LPS）诱导的抗病毒状态。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

56 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Jurkat, Lane 2: HepG2, Lane 3: MCF7, Lane 4: COS-7