TrkA Antibody [F8E20]

目录号：F4002

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生物描述

特异性 TrkA Antibody [F8E20] 可检测内源性 TrkA 总蛋白水平。
背景 TrkA，又称原肌球蛋白受体激酶A，也称为NTRK1，是Trk受体酪氨酸激酶家族中NGF特异性成员，该家族还包括TrkA、TrkB和TrkC。TrkA是一种单次跨膜糖蛋白，在发育过程中对神经元的存活、分化和轴突靶向至关重要。其胞外结构域由富含亮氨酸的D1至D3结构域组成，这些结构域具有亮氨酸重复序列（LRR）、N端和C端帽以及二硫键；其后是两个Ig样结构域D4和D5，其中D5通过对称的2:2复合物作为主要的NGF结合位点。接下来是一个短的跨膜螺旋，一个约 60 个氨基酸的近膜区，其中包含 Tyr490 和 Tyr496 处的 NPQY 基序，用于衔接蛋白对接；一个跨越残基 498 至 796 的酪氨酸激酶结构域，与 TrkB 和 TrkC 具有约 75% 的同源性，并包含一个具有 Y674 和 Y675 的激活环，用于自身磷酸化；以及一个具有 Y791 的短的 15 个氨基酸的 C 端尾部。 TrkA 的功能主要围绕 NGF 诱导的二聚化展开：配体与 D5 区的结合使胞外结构域刚性化，跨膜区 (TM) 或 JM 区螺旋的旋转引发构象变化，激活激酶不对称性，使只有一个亚基具有催化活性，从而导致 Y674 和 Y675 位点的自磷酸化作为激酶活性的读数；Y490 位点的磷酸化用于募集 Shc 和 FRS2，进而激活 Ras、Raf、MEK 和 ERK，促进细胞增殖和分化；Y785 位点的磷酸化用于募集 PLCγ，进而触发 IP3、Ca²⁺ 和 PKC 信号通路，促进神经元模式形成；PI3K 或 p85 的结合则通过 Akt 介导细胞存活。这些事件会募集衔接蛋白，进而介导轴突生长锥导向、突触可塑性以及神经嵴的增殖和成熟。 TrkA高表达是预后良好的神经母细胞瘤的标志，与生长停滞和分化相关；在成人中，它维持胆碱能神经支配和痛觉敏化。在疾病状态下，TPM3/NTRK1等融合基因以及突变或缺失可导致包括甲状腺癌、结直肠癌、肺癌和肉瘤在内的20多种肿瘤类型中TrkA的配体非依赖性激活，从而驱动肿瘤发生；而在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中，TrkA的全长过表达则与预后不良相关。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:30 1:50
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 87 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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