TSG101 Antibody (Rabbit mAb) [K21M20]

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生物描述

特异性 TSG101 Antibody (Rabbit mAb) [K21M20] 可检测内源性 TSG101 总蛋白水平。
背景 TSG101，即肿瘤易感基因101蛋白，是ESCRT-I的核心亚基。ESCRT-I是内体分选复合物（ESC）中的第一个作用复合物，ESCRT-I是内体分选机制中必需的转运机制，该机制控制泛素化货物在内体区室中的分选。该蛋白的N端结构域具有与泛素结合酶E2同源的结构折叠，但缺乏催化活性，因为真正的E2酶中存在的活性位点半胱氨酸被酪氨酸残基取代，因此该区域被称为泛素E2变体（UEV）结构域；UEV结构域还包含一个额外的N端螺旋和一个延伸的β发夹结构，这些结构在典型的E2酶中并不存在，同时缺少这些酶通常包含的两个C端螺旋。该UEV结构域包含两个功能不同的结合口袋：一个识别泛素，另一个与短的含脯氨酸的PT/SAP或PTAP四肽基序结合。对UEV结构域与HIV-1 p6 Gag蛋白的PTAP肽结合的结构分析表明，该肽对接至位于退化且失去催化活性的酶活性位点正上方的一个分叉凹槽中，其中丙氨酸-脯氨酸二肽插入到一个深口袋中，该口袋的结构与SH3和WW结构域中的脯氨酸识别口袋相似。通过PTAP基序识别，TSG101被募集到需要分拣货物的位点，HIV-1也利用了同样的募集机制，其Gag多聚蛋白携带一个PTAP晚期结构域基序，该基序与UEV结构域结合，并将TSG101以及下游的ESCRT机制募集到病毒颗粒组装的质膜位点。细胞内TSG101的耗竭会阻滞HIV-1病毒出芽的后期阶段，而TSG101的重新引入则可恢复病毒出芽，这直接将这种单一的蛋白质-蛋白质相互作用与病毒复制周期中的完整步骤联系起来。除了识别PTAP之外，UEV结构域的泛素结合口袋在病毒颗粒组装的早期阶段还发挥着独特的分子伴侣功能。因为通过药物手段破坏泛素结合会特异性地阻滞组装的起始步骤，而该步骤在机制上与后续的PTAP依赖性出芽步骤是分离的，这表明TSG101的两个UEV结合口袋支持同一整体过程中连续且不可重复的阶段。此外，TSG101还参与细胞增殖的调控和外泌体的生物合成，TSG101表达的完全缺失会导致细胞周期阻滞，进而导致胚胎死亡，这强调了TSG101的表达水平受到严格调控，而非可有可无。尽管 TSG101 早期被认为是一种肿瘤抑制因子，但在多种人类癌症中其表达升高，并且在 ESCRT 依赖性运输和病毒出芽过程中介导 PTAP 和泛素识别的相同 UEV 口袋代表了结构明确的、可成药的表面，目前正在探索用于广谱抗病毒药物的开发。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 44 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: 293T, Lane 2: A431, Lane 3: Hela, Lane 4: MCF7