UNC5B Antibody [H18P14] Datasheet

生物描述

特异性	UNC5B Antibody [H18P14] 可检测内源性 UNC5B 总蛋白水平。
背景	UNC5B，或称Unc-5同源物B，是Netrin-1依赖性受体UNC5家族的成员，分子量约为110千道尔顿。其胞外区包含两个免疫球蛋白样结构域和两个血小板反应蛋白I型重复序列，这些结构域有助于其与Netrin-1配体结合；此外，UNC5B还包含一个跨膜结构域和一个胞内区，胞内区包含ZU5、UPA和死亡结构域。这些结构域组装成一个无活性的L形闭合构象，胞内尾部包含一个caspase-3切割位点，该位点能够激活细胞凋亡信号通路。在Netrin-1缺失的情况下，UNC5B通过与ZU5、UPA和死亡结构域的相互作用诱导细胞凋亡，激活DAPK1及其下游的caspase级联反应。当Netrin-1结合时，UNC5B募集DCC或CIP2A蛋白，后者抑制磷酸酶PP2A，阻断DAPK1去磷酸化，转而激活PI3K/Akt通路，导致PIKE-A在丝氨酸472位点和MDM2在丝氨酸166和186位点磷酸化。UNC5B通过Rac和Rho GTP酶介导细胞骨架回缩，从而调节神经元生长锥和内皮细胞尖端丝状伪足中的排斥性轴突导向，进而调控神经系统发育、血管形态发生并抑制血管萌生。一种内皮细胞特异性剪接异构体，称为UNC5B delta eight，由NOVA2依赖的外显子跳跃产生，对Netrin-1不敏感，并持续诱导细胞凋亡。细胞凋亡对于血管重塑至关重要，但由于其促进肿瘤血管生成，因此与结肠癌预后不良相关。当Netrin-1过表达阻断细胞死亡通路时，UNC5B的失调可促进肿瘤存活，并导致转移和神经发育障碍。

特异性

UNC5B Antibody [H18P14] 可检测内源性 UNC5B 总蛋白水平。

背景

UNC5B，或称Unc-5同源物B，是Netrin-1依赖性受体UNC5家族的成员，分子量约为110千道尔顿。其胞外区包含两个免疫球蛋白样结构域和两个血小板反应蛋白I型重复序列，这些结构域有助于其与Netrin-1配体结合；此外，UNC5B还包含一个跨膜结构域和一个胞内区，胞内区包含ZU5、UPA和死亡结构域。这些结构域组装成一个无活性的L形闭合构象，胞内尾部包含一个caspase-3切割位点，该位点能够激活细胞凋亡信号通路。在Netrin-1缺失的情况下，UNC5B通过与ZU5、UPA和死亡结构域的相互作用诱导细胞凋亡，激活DAPK1及其下游的caspase级联反应。当Netrin-1结合时，UNC5B募集DCC或CIP2A蛋白，后者抑制磷酸酶PP2A，阻断DAPK1去磷酸化，转而激活PI3K/Akt通路，导致PIKE-A在丝氨酸472位点和MDM2在丝氨酸166和186位点磷酸化。UNC5B通过Rac和Rho GTP酶介导细胞骨架回缩，从而调节神经元生长锥和内皮细胞尖端丝状伪足中的排斥性轴突导向，进而调控神经系统发育、血管形态发生并抑制血管萌生。一种内皮细胞特异性剪接异构体，称为UNC5B delta eight，由NOVA2依赖的外显子跳跃产生，对Netrin-1不敏感，并持续诱导细胞凋亡。细胞凋亡对于血管重塑至关重要，但由于其促进肿瘤血管生成，因此与结肠癌预后不良相关。当Netrin-1过表达阻断细胞死亡通路时，UNC5B的失调可促进肿瘤存活，并导致转移和神经发育障碍。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

130 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

UNC5B Antibody [H18P14]

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使用信息

文献参考

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