Vasopressin Antibody (Rabbit mAb) [P14E10]

目录号：F4001

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生物描述

特异性 Vasopressin Antibody (Rabbit mAb) [P14E10] 可检测 Vasopressin。
背景 精氨酸加压素，又称抗利尿激素，是一种环状九肽，与载体蛋白神经垂体素II一起合成，作为较大前体的一部分。神经垂体素II在轴突运输过程中与加压素结合，并在激素释放入血液循环前储存在神经垂体内。加压素通过三种相关的G蛋白偶联受体亚型V1aR、V1bR和V2R传递信号，此外还能交叉激活结构相关的催产素受体。受体亚型决定了下游第二信使级联的激活方式。V2受体是加压素受体亚型中唯一与刺激性G蛋白Gs偶联的受体。加压素与肾集合管主细胞基底外侧膜上的V2R结合，激活腺苷酸环化酶，提高细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，并激活蛋白激酶A。 PKA通过A激酶锚定蛋白（包括AKAP18δ和AKAP220）特异性地锚定在含有水通道蛋白2（AQP2）的细胞内囊泡上。这些锚定的PKA能够磷酸化AQP2，尤其是在丝氨酸256位点，从而驱动AQP2囊泡从细胞质重新分布到顶端质膜。AQP2的这种转位完善了水的通透性通路，因为基底外侧的AQP3和AQP4是组成型表达的，它们为通过顶端AQP2进入细胞的水提供了排出途径，共同实现了净水重吸收和尿液浓缩。在PKA缺失的集合管细胞中进行的磷酸化蛋白质组学分析表明，V2R介导的血管加压素信号传导主要但不完全依赖于PKA，在水通道蛋白2丝氨酸256位点以及下游激酶（包括SPAK和非典型蛋白激酶C）中检测到残余的、PKA非依赖性磷酸化事件，表明存在一条次要的、PKA非依赖性信号通路参与了转运反应。除了cAMP-PKA轴之外，V2R激活还会激活阻遏蛋白依赖性通路，这些通路驱动受体内化和MAP激酶磷酸化，而MAP激酶磷酸化与细胞生长和增殖相关，从而将急性水通道转运与同一受体下游的长期增殖信号传导区分开来。与 V2R 不同，V1a 和 V1b 受体亚型与 Gq 偶联并激活磷脂酶 C，生成肌醇三磷酸和二酰甘油，从而动员细胞内钙并激活蛋白激酶 C，该信号通路负责加压素对周围血管的血管收缩作用，而不是其肾脏抗利尿作用。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, FCM 稀释比例
WB IP IHC FCM
1:1000 1:30 1:2000 1:500
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 17 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

IHC

Validated by Selleck

  • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded mouse hypothalamus tissue with F4001 at 1:2000 dilution.