Von Willebrand Factor Antibody (Rabbit mAb) [L10F8]

目录号：F7213

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生物描述

特异性

Von Willebrand Factor Antibody (Rabbit mAb) [L10F8] 可检测内源性 Von Willebrand Factor 总蛋白水平。
背景

血管性血友病因子（VWF）是一种由内皮细胞和巨核细胞产生的大型多聚体血浆糖蛋白，它在初级止血过程中发挥着核心作用，其功能包括将内皮下胶原蛋白连接到血小板，以及作为凝血因子VIII的特异性载体和稳定剂。该蛋白以pro-VWF的形式合成，在内质网中二聚化，并在高尔基体中进一步多聚化形成超大型多聚体，这些多聚体储存在Weibel-Palade小体和血小板α颗粒中，或分泌到血浆和内皮下基质中；其模块化结构域包括A1、A2和A3结构域，这些结构域介导关键的配体相互作用。在血管损伤部位，VWF通过其A3结构域固定在纤维状胶原蛋白上，并作为胶原基质和血小板糖蛋白Ib-IX-V之间的分子桥梁。其A1结构域与GPIbα结合，在胶原蛋白与血小板直接结合不足的高剪切力条件下，促进血小板的快速黏附和滚动。A1-GPIbα的初始结合触发血小板内的信号传导，激活整合素αIIbβ3和其他受体，从而与VWF和纤维蛋白原进一步相互作用，稳定黏附，促进血小板铺展，并形成多层聚集体以封闭损伤部位。血浆中的可溶性VWF在剪切力作用下也会解旋，与黏附的血小板结合并募集更多血小板，从而增强血栓的生长。同时，ADAMTS13的蛋白水解调控限制了超大多聚体的尺寸，防止微循环中形成不受控制的富含VWF的微血栓。除了其黏附作用外，VWF 还通过其 D′D3 区的特定位点与因子 VIII 结合，保护因子 VIII 免受蛋白水解降解和过早清除，并将其递送至活化的血小板和损伤部位，从而将初级止血与内源性凝血级联反应联系起来。VWF 的数量或质量缺陷是血管性血友病的基础，其特征是血小板黏附受损、因子 VIII 携带减少和出血表型多样；而 VWF 活性过高或失调，尤其是在 ADAMTS13 减少的情况下，会导致血栓形成，例如血栓性血小板减少性紫癜，以及在高剪切力血管床中形成动脉血栓。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, FCM 稀释比例
WB IHC FCM
1:1000-1:5000 1:50 1:500
反应性 Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 309 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Mouse spleen