WASP Antibody (Rabbit mAb) [E16K19]

目录号：F5600

打印

生物描述

特异性 WASP Antibody (Rabbit mAb) [E16K19] 可检测内源性 WASP 总蛋白水平。
背景 WASP属于WASP家族的肌动蛋白调节效应蛋白，作用于Rho家族GTP酶的下游。在静息状态下，WASP处于自身抑制构象，其GTP酶结合域与C端区域之间的分子内相互作用阻断了激活肌动蛋白成核复合物Arp2/3所需的残基。对该自身抑制的GTP酶结合域的结构分析表明，它折叠成一个紧凑的、本质上无序的肽链，并由疏水核心稳定。这种构象直接阻止了C端区域与Arp2/3的结合；小GTP酶Cdc42与GTP酶结合域的结合会引发剧烈的构象重排，破坏该疏水核心并释放C端区域，使其能够与肌动蛋白调节机制相互作用。 WASP的完全激活还需要酸性膜磷脂PIP2，因为从细胞中纯化的天然WASP在仅有GTP-Cdc42存在的情况下基本处于非活性状态，而PIP2的参与是Cdc42结合进一步刺激Arp2/3介导的肌动蛋白成核所必需的。这表明WASP的激活是通过两个独立信号在细胞膜上的协同检测实现的，而不是通过单一的调控输入。一旦被激活，暴露的C端VCA区域会将一个肌动蛋白单体直接递送至Arp2/3复合物，该单体成为新子肌动蛋白丝的第一个亚基，触发Arp2亚基上ATP的快速水解，并形成分支状肌动蛋白丝网络，为包括细胞运动和细胞骨架重组在内的各种过程提供机械力。除了其经典的胞质功能外，WASP 和 Arp2/3 复合物还会特异性地被募集到核染色质上，在同源重组修复过程中，WASP 驱动的核肌动蛋白聚合产生推进力，将这些断裂位点聚集到离散的亚核簇中。这种肌动蛋白驱动的聚集作用对 G2 期细胞周期中正在进行同源重组修复的双链断裂具有选择性，因为通过非同源末端连接修复的断裂既不表现出 Arp2/3 的富集，也不依赖于肌动蛋白成核。在核内环境中，通过药物或基因手段抑制肌动蛋白成核会特异性地损害 DNA 末端加工和同源重组修复，这表明 WASP 驱动的核肌动蛋白聚合是一种作用于受损染色质的、具有明确修复途径选择性的机制，而非一般细胞骨架活动的被动结果。 WASP 功能丧失突变会导致 Wiskott-Aldrich 综合征，这是一种 X 连锁免疫缺陷疾病，会影响血小板和淋巴细胞功能；控制细胞质肌动蛋白组装的同一 PIP2 和 Cdc42 依赖性激活开关也控制着 WASP 的核修复功能。

使用信息

抗体应用 WB, IF, FCM 稀释比例
WB IF FCM
1:500-1:1000 1:50 1:30
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 53 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: TF-1, Lane 2: U-937