Wnt3 and Wnt3a Antibody [J20B9] Datasheet

生物描述

特异性	Wnt3 and Wnt3a Antibody [J20B9] 可检测内源性 Wnt3 和 Wnt3a 总蛋白水平。
背景	Wnt3 和 Wnt3a 是密切相关的 Wnt 家族成员，均为富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，它们作为经典 Wnt/β-catenin 信号通路的强效配体，调控胚胎模式形成、干细胞维持和组织稳态。每个蛋白由约 350-400 个氨基酸组成，具有典型的 Wnt“拇指-食指”结构，其 N 端和 C 端结构域由多个二硫键稳定，并经 N-糖基化修饰。此外，保守丝氨酸残基（Wnt3 中的 Ser212，Wnt3a 中的 Ser209）上的关键 O-棕榈油酰化修饰对于与载体 Wntless 结合进行分泌以及与 Frizzled 受体高亲和力结合至关重要。 Wnt3 和 Wnt3a 在细胞表面与 Frizzled/LRP5 6 受体复合物结合，募集并激活 Dishevelled，抑制 Axin/APC/CK1/GSK 3β 破坏复合物，稳定胞质 β-catenin，并驱动其在细胞核内积累，在那里与 TCF/LEF 结合，诱导靶基因（如 cc-MYC、CCND1（细胞周期蛋白 D1）、AXIN2 和 HOXB4）的表达，从而促进增殖、存活和干性；因此，Wnt3 和 Wnt3a 对于轴的形成、肢体和神经发育以及造血、神经和肠道干细胞的调控至关重要，它们的作用部分重叠但具有情境特异性（例如，Wnt3a 维持神经前体细胞增殖，Wnt3 在某些脊髓区域更强烈地偏向神经发生）。 WNT3 功能丧失突变会导致常染色体隐性四肢畸形，伴有严重的肢体和颅面畸形；而 Wnt3/Wnt3a 驱动的 β-catenin 信号异常上调会通过驱动不受控制的细胞周期进入、EMT 和对细胞凋亡的抵抗，促进结直肠癌、乳腺癌、肺癌和其他癌症的发生；Wnt3a 信号失调也与骨骼和神经退行性疾病有关。

特异性

Wnt3 and Wnt3a Antibody [J20B9] 可检测内源性 Wnt3 和 Wnt3a 总蛋白水平。

背景

Wnt3 和 Wnt3a 是密切相关的 Wnt 家族成员，均为富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，它们作为经典 Wnt/β-catenin 信号通路的强效配体，调控胚胎模式形成、干细胞维持和组织稳态。每个蛋白由约 350-400 个氨基酸组成，具有典型的 Wnt“拇指-食指”结构，其 N 端和 C 端结构域由多个二硫键稳定，并经 N-糖基化修饰。此外，保守丝氨酸残基（Wnt3 中的 Ser212，Wnt3a 中的 Ser209）上的关键 O-棕榈油酰化修饰对于与载体 Wntless 结合进行分泌以及与 Frizzled 受体高亲和力结合至关重要。 Wnt3 和 Wnt3a 在细胞表面与 Frizzled/LRP5 6 受体复合物结合，募集并激活 Dishevelled，抑制 Axin/APC/CK1/GSK 3β 破坏复合物，稳定胞质 β-catenin，并驱动其在细胞核内积累，在那里与 TCF/LEF 结合，诱导靶基因（如 cc-MYC、CCND1（细胞周期蛋白 D1）、AXIN2 和 HOXB4）的表达，从而促进增殖、存活和干性；因此，Wnt3 和 Wnt3a 对于轴的形成、肢体和神经发育以及造血、神经和肠道干细胞的调控至关重要，它们的作用部分重叠但具有情境特异性（例如，Wnt3a 维持神经前体细胞增殖，Wnt3 在某些脊髓区域更强烈地偏向神经发生）。 WNT3 功能丧失突变会导致常染色体隐性四肢畸形，伴有严重的肢体和颅面畸形；而 Wnt3/Wnt3a 驱动的 β-catenin 信号异常上调会通过驱动不受控制的细胞周期进入、EMT 和对细胞凋亡的抵抗，促进结直肠癌、乳腺癌、肺癌和其他癌症的发生；Wnt3a 信号失调也与骨骼和神经退行性疾病有关。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:10000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

39 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: CHO, Lane 2: CHO(Human Wnt3a transfected)