XIAP Antibody [L24L9] Datasheet

生物描述

特异性	XIAP Antibody [L24L9] 可检测内源性 XIAP 总蛋白水平。
背景	XIAP 是人类 IAP 家族中最有效的成员，由 497 个氨基酸组成，它通过三个串联的 N 端 BIR 结构域（BIR1 至 BIR3，每个约 70 个氨基酸，形成 Zn²⁺ 螯合的三螺旋束）、一个 UBA 泛素结合模块和一个 C 端 RING E3 连接酶结构域（跨越氨基酸 354 至 447，具有用于自身泛素化和底物降解的 C3HC4 基序）与活性 caspase 结合，从而直接抑制细胞凋亡的执行。 BIR2结构域（氨基酸132至195）利用其连接环插入caspase-3和caspase-7的活性位点，通过His237和Arg237的相互作用阻断催化；BIR3结构域（氨基酸249至309）通过Smac结合槽（也称为IBD口袋）与caspase-9单体结合，其中Trp323和His322形成疏水钳，作用于N端AVPI基序；BIR1稳定该复合物；RING结构域泛素化caspase和Smac，使其被蛋白酶体降解。XIAP是一种caspase抑制剂，它通过阻止BID的切割，有效抑制caspase-8和caspase-10介导的外源性凋亡，并通过在caspase-9凋亡体处隔离已激活的caspase，抑制内源性凋亡。 XIAP 还可通过 RIPK1 或 RIPK2 的泛素化激活非经典 NF-κB 信号通路，从而促进细胞存活和炎症反应，并在线粒体中发挥作用，增强细胞对线粒体外膜通透性的抵抗力。XIAP 对免疫稳态至关重要，支持 T 细胞和 NK 细胞的存活，维持上皮完整性，并促进正常发育。XIAP 基因突变会导致 X 连锁淋巴增生综合征；Smac 或 DIABLO 蛋白通过与 BIR2 和 BIR3 竞争性结合来解除 XIAP 的抑制。XIAP 过表达通过稳定 caspase 和激活 NF-κB 来驱动癌细胞的化疗耐药性和肿瘤发生，因此 Smac 模拟物成为其治疗靶点。XIAP 的半合子缺失会导致 XLP-2，进而引发致命的 EBV 相关淋巴增生性疾病。

特异性

XIAP Antibody [L24L9] 可检测内源性 XIAP 总蛋白水平。

背景

XIAP 是人类 IAP 家族中最有效的成员，由 497 个氨基酸组成，它通过三个串联的 N 端 BIR 结构域（BIR1 至 BIR3，每个约 70 个氨基酸，形成 Zn²⁺ 螯合的三螺旋束）、一个 UBA 泛素结合模块和一个 C 端 RING E3 连接酶结构域（跨越氨基酸 354 至 447，具有用于自身泛素化和底物降解的 C3HC4 基序）与活性 caspase 结合，从而直接抑制细胞凋亡的执行。 BIR2结构域（氨基酸132至195）利用其连接环插入caspase-3和caspase-7的活性位点，通过His237和Arg237的相互作用阻断催化；BIR3结构域（氨基酸249至309）通过Smac结合槽（也称为IBD口袋）与caspase-9单体结合，其中Trp323和His322形成疏水钳，作用于N端AVPI基序；BIR1稳定该复合物；RING结构域泛素化caspase和Smac，使其被蛋白酶体降解。XIAP是一种caspase抑制剂，它通过阻止BID的切割，有效抑制caspase-8和caspase-10介导的外源性凋亡，并通过在caspase-9凋亡体处隔离已激活的caspase，抑制内源性凋亡。 XIAP 还可通过 RIPK1 或 RIPK2 的泛素化激活非经典 NF-κB 信号通路，从而促进细胞存活和炎症反应，并在线粒体中发挥作用，增强细胞对线粒体外膜通透性的抵抗力。XIAP 对免疫稳态至关重要，支持 T 细胞和 NK 细胞的存活，维持上皮完整性，并促进正常发育。XIAP 基因突变会导致 X 连锁淋巴增生综合征；Smac 或 DIABLO 蛋白通过与 BIR2 和 BIR3 竞争性结合来解除 XIAP 的抑制。XIAP 过表达通过稳定 caspase 和激活 NF-κB 来驱动癌细胞的化疗耐药性和肿瘤发生，因此 Smac 模拟物成为其治疗靶点。XIAP 的半合子缺失会导致 XLP-2，进而引发致命的 EBV 相关淋巴增生性疾病。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

53 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: Raji, Lane 3: COS