XPB Antibody (Rabbit mAb) [D23K21]

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生物描述

特异性 XPB Antibody (Rabbit mAb) [D23K21] 可检测内源性 XPB 总蛋白水平。
背景 XPB (ERCC3) 是一种 SF2 家族的 ATP 依赖性 DNA 解旋酶，它是十蛋白转录因子 IIH (TFIIH) 复合物的关键催化亚基，在转录起始和核苷酸切除修复 (NER) 过程中，它将 ATP 水解与 DNA 易位和局部双链解开偶联起来。该蛋白包含两个 RecA 样解旋酶结构域，两侧是辅助元件，包括一个保守的拇指结构域和一个损伤识别区。对古细菌和人类 XPB 的结构分析表明，其存在一种“旋转和推动”机制，其中 ATP 驱动的构象变化使这些结构域从开放状态重新定向到闭合状态，从而在靶位点周围产生具有特定 3′–5′ 极性的短 DNA 气泡。在启动子区域的TFIIH中，XPB作为下游双链DNA上的3′→5′易位酶发挥作用，施加扭矩打开转录泡，使RNA聚合酶II启动合成，同时将CAK激酶模块（CDK7-cyclin H-MAT1）锚定到TFIIH上，从而将启动子开放与聚合酶C端结构域的磷酸化和细胞周期信号传导整合起来。在核苷酸切除修复（NER）过程中，XPB与5′→3′解旋酶XPD协同作用，确定并扩展围绕大体积损伤（例如紫外线诱导的嘧啶二聚体或顺铂加合物）的修复泡；XPB有限的解旋酶活性打开双链DNA上一个精确定位的小区域，随后XPD进一步解旋并验证该区域，之后XPG和ERCC1-XPF进行双重切口切除受损链。在古细菌系统中，XPB 与结构特异性核酸内切酶 Bax1 形成解旋酶-核酸酶机器：XPB 延伸 DNA 气泡，而 Bax1 在与真核生物 XPG 切割位点对应的位置切割扭曲的 DNA。XPB 的拇指结构域和损伤识别结构域对于这种协同的气泡延伸和切割活性至关重要，这为理解真核生物 XPB 与 NER 核酸酶的协调作用提供了结构框架。在人类细胞中，XPB 的翻译后修饰调控 TFIIH 的修复能力。酪蛋白激酶 II 对丝氨酸 751 的磷酸化增强了 TFIIH 的 NER 活性，而 XPB 的去磷酸化或抑制则降低了修复效率。这表明 XPB 的 ATPase/转位酶功能受到响应 DNA 损伤的信号通路调控。 XPB 的突变会损害解旋酶活性、TFIIH 组装或募集，导致着色性干皮病 B 组和 XP-Cockayne 综合征或毛发硫营养不良表型，其特征是极度紫外线过敏、全基因组和转录偶联 NER 缺陷，在某些情况下还会出现神经系统缺陷，这反映了 XPB 作为基因组管理员在转录、修复和细胞凋亡交叉点的核心作用。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
WB IF
1:1000 - 1:10000 1:500
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 89 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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