ZO1 tight junction protein Antibody (Rabbit mAb) [C21G5]

目录号：F0013

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生物描述

特异性 ZO1 tight junction protein Antibody (Rabbit mAb) [C21G5] 可检测内源性 ZO1 tight junction protein 总蛋白水平。
背景 ZO1紧密连接蛋白（TJP1）是一种膜相关鸟苷酸激酶（MAGUK）家族支架蛋白，定位于上皮和内皮细胞的紧密连接处，将跨膜连接蛋白与皮质肌动蛋白细胞骨架连接起来，从而参与屏障形成、细胞极性和连接信号传导。ZO-1包含三个N端PDZ结构域，其后依次连接一个SH3结构域、一个鸟苷酸激酶样结构域和一个富含脯氨酸的C端区域。这种结构使其能够同时结合多个蛋白：claudin蛋白和连接黏附分子与PDZ结构域结合；occludin蛋白和ZO-2蛋白结合于MAGUK样N端半部分；F-肌动蛋白与独特的C端片段结合，从而在紧密连接链和连接周围肌动球蛋白环之间形成结构桥梁。这种模块化结构通过稳定顶端侧膜上的claudin基孔和occludin基链，并将其与细胞骨架连接，从而支持紧密连接的组装。ZO-1蛋白N端半段内一段特定的244个氨基酸区域对于其稳定整合到成熟的连接复合物中至关重要。ZO-1及其旁系同源蛋白ZO-2对于早期连接生物发生和屏障功能不可或缺，因为这两种蛋白的缺失会阻止形态和功能完整的紧密连接的形成，并导致胚胎致死，同时伴有上皮组织、卵黄囊血管生成和增殖缺陷，这凸显了它们在细胞旁通透性控制和组织形态发生中的核心作用。在已形成的细胞连接处，ZO-1通过维持紧密连接元件与连接周围肌动蛋白-肌球蛋白带之间的连接来稳定溶质屏障，选择性地限制较大溶质的通量，同时允许小离子通过claudin孔道的转运。ZO-1的缺失会导致大分子通透性增加，并伴随顶端肌动蛋白和肌球蛋白的重组。ZO-1还参与与黏附连接的相互作用以及细胞间张力的调控，与VE-钙黏蛋白和afadin等成分相互作用，并参与调控细胞迁移、血管生成行为和机械敏感性转录网络的信号通路，包括连接处MAGUK蛋白的YAP相关输出。ZO-1表达失调或定位异常与上皮屏障破坏、炎症和纤维化以及癌变进展相关，在这些过程中，紧密连接完整性和连接信号传导的改变会影响侵袭、通透性和对微环境信号的反应。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:50 1:100 - 1:200
反应性 Human, Monkey
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 195 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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