Activated/monophosphorylated ERK1/2 Antibody [F9B19]

目录号: F4943

抗体应用：反应性：Rat, Human

Lane 1: Jurkat, Lane 2: Jurkat (TPA, 200nM, 10min)

规格	价格	库存
20uL	790	现货
50uL	1240	现货
100uL	1990	现货
100uL*2	3790	现货
400-668-6834 info@selleck.cn

使用信息

稀释比例
WB1:4000

抗体应用
WB, IF, ELISA

反应性
Rat, Human

抗体类型
Mouse Monoclonal Antibody

储存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件(自收到货起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

预测分子量
42, 44 kDa

阳性对照	Rat testis; Human small intestine; Rat brain; HeLa cells; NIH/3T3 cells; PC-12 cells
阴性对照

实验方法

WB
实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

IF
实验步骤：样品准备 1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。 2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。 3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。 4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。固定 1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。 2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。通透 1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。） 2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。封闭添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。免疫荧光染色（第一天） 1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。 2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。免疫荧光染色（第二天） 1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。 2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。 3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。 4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光孵育 5~10 min。 5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。封片 1. 抗荧光淬灭封片剂封片。 2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。 3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

实验步骤：

样品准备

1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。

2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。

3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。

4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。

固定

1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。

2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。

通透

1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。

（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）

2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。

封闭

添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）

注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。

免疫荧光染色（第一天）

1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。

2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。

免疫荧光染色（第二天）

1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。

2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。

3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。

4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光孵育 5~10 min。

5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。

封片

1. 抗荧光淬灭封片剂封片。

2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。

3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特异性
Activated/monophosphorylated ERK1/2 Antibody [F9B19] 可检测内源性活化/单磷酸化 ERK1/2 蛋白水平。

蛋白定位
内膜系统，线粒体，线粒体外膜

Uniprot ID
Q15388

克隆号
F9B19

别名
Mitogen-activated protein kinase 1; MAP kinase 1; MAPK 1; ERT1; Extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK-2); p42-MAPK; Mitogen-activated protein kinase 2 (MAP kinase 2; MAPK 2); MAPK1; ERK2; PRKM1; PRKM2

背景
活化/单磷酸化的 ERK1/2 指的是细胞外信号调节激酶 1 和 2 的中间活化状态，它们是 CMGC 激酶家族中 MAPK/ERK 通路的脯氨酸导向丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有保守的双叶结构激酶结构域、N 端延伸部分相差 17 个残基（ERK1 与 ERK2）、含有 TEY 基序的活化环（ERK1 中的 Thr183/Glu184/Tyr185，ERK2 中的 Thr185/Glu187/Tyr187）以及 MEK 底物的对接槽（D 基序：LXL 上游的碱性残基），其中 Tyr 的单磷酸化（由 MEK1/2 进行）先于 Thr 的磷酸化，从而产生完全活化的 pThr-pTyr-ERK。酪氨酸磷酸化部分地重新定位了激活片段，增强了MEK的对接亲和力，而苏氨酸位点则保持不可接近状态，直到双重修饰触发C螺旋旋转约14°，激活唇结构发生重构以识别Pro-X-pSer/pThr-Pro，以及催化Asp-Phe-Gly (DFG)基序的有序化。尽管这种磷酸化是短暂的，但它在双相激活过程中维持了部分催化活性（初始阶段酪氨酸快速爆发发生在5-10分钟，随后在G1期持续波动），促进核转位（15分钟内通过importin-7/ERKAP1），RSK1-3磷酸化（胞质-核中继放大Elk-1/Sap-1a/三元复合物因子介导的c-fos/c-jun早期基因表达），并通过抑制CDK抑制剂（通过cyclin D1/Myc抑制p21/p27）来促进G1/S期进程，同时激活AP-1以促进细胞增殖。单磷酸ERK协调对促分裂原（RTK的Ras/Raf/MEK级联反应）的梯度反应，其中ERK2主导核内积累（约占ERK1的70%），这对于PCNA/细胞周期蛋白B1的上调至关重要，也是细胞进入S期所必需的；磷酸酶敏感性（酪氨酸磷酸酶PTP-SL/STEP，苏氨酸磷酸酶PP2A/PP2C）确保了反馈调节。ERK信号通路与癌症密切相关，BRAF突变导致的组成型激活驱动肿瘤发生，而抑制剂则靶向双磷酸化状态；在神经退行性疾病中，ERK活性受损会破坏突触可塑性；在炎症中，该通路参与病理性免疫反应。

背景

活化/单磷酸化的 ERK1/2 指的是细胞外信号调节激酶 1 和 2 的中间活化状态，它们是 CMGC 激酶家族中 MAPK/ERK 通路的脯氨酸导向丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有保守的双叶结构激酶结构域、N 端延伸部分相差 17 个残基（ERK1 与 ERK2）、含有 TEY 基序的活化环（ERK1 中的 Thr183/Glu184/Tyr185，ERK2 中的 Thr185/Glu187/Tyr187）以及 MEK 底物的对接槽（D 基序：LXL 上游的碱性残基），其中 Tyr 的单磷酸化（由 MEK1/2 进行）先于 Thr 的磷酸化，从而产生完全活化的 pThr-pTyr-ERK。酪氨酸磷酸化部分地重新定位了激活片段，增强了MEK的对接亲和力，而苏氨酸位点则保持不可接近状态，直到双重修饰触发C螺旋旋转约14°，激活唇结构发生重构以识别Pro-X-pSer/pThr-Pro，以及催化Asp-Phe-Gly (DFG)基序的有序化。尽管这种磷酸化是短暂的，但它在双相激活过程中维持了部分催化活性（初始阶段酪氨酸快速爆发发生在5-10分钟，随后在G1期持续波动），促进核转位（15分钟内通过importin-7/ERKAP1），RSK1-3磷酸化（胞质-核中继放大Elk-1/Sap-1a/三元复合物因子介导的c-fos/c-jun早期基因表达），并通过抑制CDK抑制剂（通过cyclin D1/Myc抑制p21/p27）来促进G1/S期进程，同时激活AP-1以促进细胞增殖。单磷酸ERK协调对促分裂原（RTK的Ras/Raf/MEK级联反应）的梯度反应，其中ERK2主导核内积累（约占ERK1的70%），这对于PCNA/细胞周期蛋白B1的上调至关重要，也是细胞进入S期所必需的；磷酸酶敏感性（酪氨酸磷酸酶PTP-SL/STEP，苏氨酸磷酸酶PP2A/PP2C）确保了反馈调节。ERK信号通路与癌症密切相关，BRAF突变导致的组成型激活驱动肿瘤发生，而抑制剂则靶向双磷酸化状态；在神经退行性疾病中，ERK活性受损会破坏突触可塑性；在炎症中，该通路参与病理性免疫反应。

参考文献
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27376062/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22569528/

PVDF膜孔径规格选择参照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

技术支持

在订购、运输、储存和使用我们的产品的任何阶段，您遇到的任何问题，均可以通过拨打我们的热线电话400-668-6834，或者技术支持邮箱tech@selleck.cn，直接联系到我们。我们会在24小时内尽快联系您。

* 必填项

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%