Anti-Flag免疫磁珠

磁珠预处理
1、用移液枪轻柔吹打重悬Anti-Flag免疫磁珠，转移20 μL磁珠悬液到新的离心管中。
2、加入500 μL TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)，用移液枪轻柔吹打重悬磁珠，磁力架上静置1~2 min（也可适当延长至5min），去除上清，重复上述步骤两次。
注意：多个样品时，可磁珠预处理后再分装到各个反应管中。去除上清时，请用枪头轻轻吸取，吸力过大可能会导致部分磁珠损失。
样品的结合
3、在上述沉淀中加入200 μL细胞裂解液，用移液枪轻柔吹打重悬磁珠，然后室温孵 育2 h或者4 ℃条件下过夜。
4、磁力架上静置1-2 min（可适当延长）后，将上清液转移到新的离心管中备用（上清液可用于检测 Flag-tag蛋白是否存在残留）。
洗涤
5、向上述沉淀中加入500 μL PBST (NaCl 136.89 mM; KCl 2.67 mM; Na2HPO4 8.1 mM; KH2PO4 1.76 mM; 0.5% Tween20)，用手轻敲或轻柔地吹打重新分散磁珠，然 后上下翻转样品5 min。磁性分离后移除上清。
6、重复上述步骤两次。如遇到非特异性杂蛋白去除不干净的情况，请延长清洗时间、 增加清洗次数或适当增加清洗液中去垢剂的含量。
蛋白洗脱
根据下游用途选择不同的洗脱方法，进行免疫共沉淀可直接进行7-8步；进行蛋白纯化可根据后续实验，选择多肽竞争性洗脱（9-10步）或低pH洗脱（11-12步）。
变性洗脱（适用于利用anti-Flag beads进行免疫共沉淀实验）：
7、对于直接检测目的蛋白的情况，在上述所得沉淀中加入50 μL 1×蛋白上样缓冲液，煮沸5 min，冷却至室温并在磁力架上静置1-2 min（可适当延长）。
8、取上清进行SDS-PAGE检测。
Poly FLAG多肽竞争性洗脱（适用于利用anti-Flag beads进行蛋白纯化实验）：
9、将含有200 μg-1 mg/mL Poly Flag多肽（B23111）的TBS缓冲液加入步骤6的产物中，Poly Flag多肽缓冲液体积为磁珠使用量的5倍，4℃摇床孵育洗脱2 h（为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱）。
10、将上述步骤得到的产物进行磁性分离，将包含目的蛋白的上清转移到新的EP管中。磁珠如需重复使用，需用0.1 M glycine HCl (pH 3.0)进行清洗后再回收。
低pH洗脱（适用于利用anti-Flag beads进行蛋白纯化实验）：
11、将0.1 M glycine HCl (pH 3.0)洗脱液加入步骤6中的产物中，洗脱液体积为磁珠使用量的5倍，摇床孵育洗脱5 min，洗脱时间不得超过20 min。
12、将上述产物进行磁力分离，取洗脱产物立即加入1 M Tris (pH 8.0)进行中和，并调节pH直至中性。