Anti-Flag亲和凝胶

仅限科研使用

Selleck Anti-Flag亲和凝胶由高质量的鼠源 IgG2b 单克隆抗体与sepharose 4B gel 通过共价偶联制备，本产品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量（至少为1.1mg protein /ml gel），杂蛋白非特异结合少，可用于蛋白质免疫共沉淀和少量蛋白质纯化。

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价格对比

产品描述

产品性质

抗体克隆号	1E6
抗体亚型	鼠源IgG2b
抗体纯化方法	Protein A 纯化制备
抗体结合量	7.5 克抗体/升gel
适用范围	蛋白质免疫共沉淀，蛋白质纯化
推荐使用体积	蛋白质免疫共沉淀: 500μl 细胞裂解液使用 5μl gel
融合蛋白结合容量	至少为1.1mg protein/ml gel
结合特性	甲硫氨酸修饰的N端Flag融合蛋白：Met-FLAG–Protein N端Flag 融合蛋白：FLAG–Protein C端 Flag 融合蛋白：Protein-FLAG
运输条件	4°C 冰袋

产品储存溶剂

Selleck Anti-Flag Affinity Gel 储存溶剂：10 mM Na₃PO₄, 150 mM NaCl, 50% 甘油, pH 7.4，含有0.02%（w/v）叠氮化钠。

储存条件(自收到货起)

未开封的产品可在-20℃稳定保存2年。使用后需保存在储存溶剂（50%甘油，10 mM Na₃PO₄，150 mM NaCl，0.02%叠氮化钠，pH7.4）中并且禁止在不含甘油的溶剂中冻存。

实验方法

凝胶预处理

1、轻微重悬Anti-Flag Affinity Gel使均一，迅速转移10 μL混合液（约5 μL纯胶）至新的离心管中。
2、加入500 μL TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)，轻轻混匀，5,000 rpm离心30s，弃上清，重复上述步骤3-4次。

样本的结合

3、上述的凝胶中加入50-200 μL细胞裂解液，然后室温孵育2 h或4 ℃条件下过夜。
4、5,000 rpm离心30s，将上清液转移到新的离心管中备用（上清液可用于检测Flag-tag蛋白是否存在残留）。

洗涤

5、向上述沉淀中加入500 μL PBST（NaCl 136.89 mM; KCl 2.67 mM;Na₂HPO₄ 8.1 mM; KH₂PO₄ 1.76 mM；0.5% Tween20），用移液器轻柔地吹打重新分散凝胶，然后上下翻转样品5 min。5000rpm离心30s，弃上清。
6、重复上述步骤两次。如遇到非特异性杂蛋白去除不干净的情况，请延长清洗时间、增加清洗次数或适当增加清洗液中去垢剂的含量。

洗脱

根据下游用途选择不同的洗脱方法，进行免疫共沉淀可直接进行7-8步；进行蛋白纯化可根据后续实验，选择多肽竞争性洗脱（9-10步）或low pH洗脱（11-12步）

变性洗脱（适用于利用Anti-Flag Affinity Gel进行免疫共沉淀实验）：

7、对于直接检测目的蛋白的情况，在上述所得沉淀中加入50 μL 1×蛋白上样缓冲液，煮沸5 min，冷却至室温并离心。
8、取上清进行SDS-PAGE检测。

Poly FLAG多肽竞争性洗脱（适用于利用Anti-Flag Affinity Gel进行蛋白纯化实验）：

9、将含有200 ug-1 mg/ml Poly Flag多肽(B23111)的TBS缓冲液加入步骤6的产物中，Poly FLag多肽缓冲液体积为凝胶使用量的5倍，4℃摇床孵育洗脱2 hour（为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱）
10、将上述步骤得到的产物进行离心（5000rpm，30s），将包含目的蛋白的上清转移到新的EP管中。凝胶如需重复使用，需用0.1M glycine HCl（pH 3.0）进行清洗后再回收。

低pH洗脱（适用于利用Anti-Flag Affinity Gel进行蛋白纯化实验）：

11、将0.1M glycine HCl（pH 3.0）洗脱液加入步骤6中的产物中，洗脱液体积为凝胶使用量的5倍，摇床孵育洗脱5min，洗脱时间不得超过20 min。
12、将上述产物进行离心（5000rpm，30s），将洗脱产物立即加入1M Tris（pH 8.0）进行中和，并调节pH直至中性。

Selleck同时提供Poly FlAG多肽冻干粉，可以更温和有效地洗脱目标蛋白产物。