鼠尾直接PCR试剂盒(快速基因型鉴定)
仅限科研使用
鼠尾直接PCR试剂盒专为小鼠快速基因型鉴定（快速基因型鉴定）而研制。试剂盒中包含的高效组织消化液（Buffer L, Protease Plus）能够迅速从小鼠尾巴、耳朵或脚趾等组织中释放足量的基因组DNA，消化时间仅需15分钟，无需抽提与纯化，可直接将消化产物作为模板加入抗干扰型2 x M-PCR Mix中进行PCR扩增，PCR扩增产物可直接点样进行电泳观察。
产品优势
操作简单：无需DNA提取，裂解液直接PCR鉴定；
省时：比传统方法节约13h（以基因组DNA为例）。
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价格对比
产品描述
本试剂盒专为小鼠快速基因型鉴定（Genotyping）而研制。试剂盒中包含的高效组织消化液（Buffer L, Protease Plus）能够迅速从小鼠尾巴、耳朵或脚趾等组织中释放足量的基因组DNA，消化时间仅需15分钟，无需抽提与纯化，可直接将消化产物作为模板加入抗干扰型2 x M-PCR Mix中进行PCR扩增，PCR扩增产物可直接点样进行电泳观察。实验操作简便而省时。
应用范围
小鼠基因型鉴定（尾巴、耳朵或脚趾）
小鼠基因组DNA扩增、测序
结果分析：
Mouse Direct PCR Kit对鼠尾、鼠趾、鼠耳都适用，55℃消化15min和30min的效果无显著性差异，对于大片段3Kb也能有效扩增。
注：其中片段500bp和3Kb左右的引物是根据小鼠GAPDH基因设计的；片段1Kb和2Kb的引物是根据小鼠Ppip5k2基因设计的。
产品组成
| Complete Kit | B40013 (200 rxns) | B40015 (500 rxns) |
|---|---|---|
| Buffer L (mL) | 20 | 50 |
| Protease Plus (mL) | 0.4 | 1 |
| 2 x M-PCR OPT Mix (mL) | 2 | 5 |
| User Guide | Yes | Yes |
储存条件(自收到货起)
Buffer L 4℃保存，其余组分-20℃保存。保质期2年。
实验方法
1. 组织消化
1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：
| 单样本 | |
|---|---|
| Protease Plus | 2 μL |
| Buffer L | 100 μL |
组织消化液现用现配，充分混匀后使用。
1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消 化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。
1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。
2. PCR扩增
2.1. PCR反应体系：
反应体系的配制最好于低温环境下（如冰浴）完成，以保证PCR扩增效率和扩增特异性。
| PCR 反应组分 | 20 μL 反应体系 (μL) | 50 μL 反应体系 (μL) |
|---|---|---|
| ddH2O | 8 | 21 |
| 正向引物 (10 μM) | 0.5 | 1 |
| 反向引物 (10 μM) | 0.5 | 1 |
| 模板（消化产物） | 1 | 2 |
| 2 x M-PCR OPTI Mix | 10 | 25 |
注：模板体积可以适当调整。
2.2. PCR反应条件：
| 温度 (℃) | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|
| 94 | 5 min | 1 |
| 94 | 20 sec | 35 |
| 50-65 | 30 sec | |
| 72 | X min (2 kb /min) | |
| 72 | 5 min | 1 |
| 12 | -- | 1 |
PCR产物的3’端带有碱基A，可直接克隆至T载体，用于DNA测序。
3. 琼脂糖凝胶电泳
试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。
常见问题及解决方法
| 常见问题 | 可能原因 | 对策 |
|---|---|---|
| 样本组与阳性对照组均无扩增条带 | 长期存储或存储条件不当导致试剂失活 | 使用新的试剂盒 |
| 引物质量问题 | 重新设计合成引物 | |
| 退火温度过高 | 建议每2℃为一个梯度降低退火温度，摸索最佳条件 | |
| 延伸时间过短或循环数过少 | 适当增长延伸时间或提高循环数至36-40 Cycles | |
| 样本组无扩增条带而阳性对照组正常 | 未充分消化组织样本 | 将消化时间延长至30 min |
| 加入过多模板抑制PCR | 降低模板用量 | |
| 未完全灭活蛋白酶活性 | 消化产物在95℃加热5 min | |
| 有非特异性扩增条带 | PCR引物错配 | 重新设计PCR引物 |
| PCR体系配制不当（引物浓度或DNA模板浓度过高） | 适当降低引物和模板用量 | |
| PCR反应条件设置不当（退火温度过低或循环数过高） | 适当提高退火温度或降低循环数 | |
| 配制PCR体系时环境温度过高或体系配制完成到PCR仪反应间隔时间过久 | 在冰浴环境下配制PCR反应体系，完成后尽快放入PCR仪中开始反应 | |
| 阴性对照出现目的条带 | PCR试剂或操作工具污染 | 使用新的试剂，重新高压灭菌ddH2O和PCR用品。操作过程中动作尽量轻柔，避免加样溅出污染其他样品 |
| 实验结果重复性不好 | 试剂活性不稳定或DNA模板降解 | 低温保存所有试剂，重新提取样本基因组DNA |
| 样本DNA交叉污染 | 建议每个取样器只取一个样本，或取完一个样本后，将取样器刃口浸没在75%酒精或2%次氯酸钠溶液中反复涮洗，用干净的纸巾擦干后，再取下一个样本 | |
| PCR产物交叉污染 | 操作过程中动作尽量轻柔，避免管中PCR产物溅出污染其他样品。电泳上样过程中，小心加入适量PCR产物到相应泳道中，避免上样过多溢出或动作过大而污染相邻泳道样品。注意勤换枪头以避免产物交叉污染 |
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