CD147 Antibody [D10H20]
目录号: F5066
抗体应用：
反应性：
-
Lane 1: HepG2, Lane 2: DLD-1, Lane 3: NCI-H226
操作要点
WB
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
湿转参考条件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀释比例 |
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| 抗体应用 |
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| WB, IHC |
| 反应性 |
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| Human |
| 抗体类型 |
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| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 储存液配方 |
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| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 储存条件(自收到货起) |
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| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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预测分子量
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38-58 kDa
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| 阳性对照 | Human lung carcinoma; human ovarian carcinoma; Ramos cells; Hep G2 cells; HCT‑15 cells; DLD‑1 cells; 786‑O cells; NCI‑H226 cells |
|---|---|
| 阴性对照 | MDA‑MB‑231 cells; Ramos cells (PNGase F‑treated) |
实验方法
| WB |
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实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
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实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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生物描述
| 特异性 |
|---|
| CD147 Antibody [D10H20] 可检测内源性 CD147 总蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 细胞膜，细胞突起，内质网，内体，内膜系统 |
| Uniprot ID |
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| P35613 |
| 克隆号 |
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| D10H20 |
| 别名 |
|---|
| Basigin; 5F7; Collagenase stimulatory factor; Extracellular matrix metalloproteinase inducer; EMMPRIN; Leukocyte activation antigen M6; OK blood group antigen; TCSF; CD147; BSG |
| 背景 |
|---|
| CD147，又称basigin或EMMPRIN，是一种I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，具有两个胞外Ig样结构域、一个跨膜区和一个短的胞质尾，该胞质尾支持同型和异型相互作用。CD147主要以高度糖基化的亚型存在，其中主要形式通过二聚化和配体结合驱动大部分生物学活性。CD147通过同型相互作用协调邻近成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶（MMP），提高MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9的水平，从而在组织侵袭和重塑过程中重塑细胞外基质。它还能将单羧酸转运蛋白MCT1和MCT4转运至质膜，促进乳酸外流，从而在缺氧条件下维持糖酵解，进而为增殖细胞中的瓦博格效应提供能量。 TGF-β刺激通过Slug与其启动子结合，在转录水平上上调CD147，进而增强TGF-β的表达，并通过下调E-钙黏蛋白、上调N-钙黏蛋白和波形蛋白，以及激活PI3K/Akt/GSK3β/Snail/Slug信号通路，触发上皮-间质转化（EMT）。CD147与亲环蛋白、整合素（如α3β1和α6β1）以及caveolin-1的相互作用，调节ERK、NF-κB和VEGF信号通路，并通过ABCG2和P-糖蛋白的稳定作用促进血管生成、抗凋亡和化疗耐药。作为恶性疟原虫PfRh5在红细胞上的重要受体，CD147在紧密连接形成过程中与Rh5结合，介导寄生虫入侵。 CD147还参与精子发生、视网膜营养物质运输、通过α4整合素调控促进白细胞黏附，并通过MMP和VEGF调控促进滋养层细胞侵袭。在肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和其他癌症中，CD147的过表达标志着疾病进展，并与预后不良、转移和治疗耐药性相关；而CD147的缺乏则会抑制肿瘤模型中的肿瘤生长和侵袭。 |
| 参考文献 |
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